耐碳青霉烯肠杆菌科(CRE)被世卫组织描述为“极其重要”的重点病原体，可引起严重和难以治疗的感染，其中肺炎克雷伯菌的发病率最高，占所有CRE的57%-74%。由于世界范围内日益增加的细菌多重耐药性，肺炎克雷伯菌有可能导致极难治疗的感染。因此，在临床诊断中快速、准确地鉴定多重耐药肺炎克雷伯菌对其预防和感染控制具有重要意义。然而，传统和分子方法的局限性严重阻碍了病原体的及时诊断。
表面增强拉曼散射 (SERS) 光谱作为一种无标记、无创、低成本的方法，因其在微生物病原体诊断中的应用潜力而受到广泛关注。本研究将深度学习技术和SERS相结合，同时区分和预测具有碳青霉烯类敏感（CSKP）、碳青霉烯类耐药（CRKP）和多粘菌素耐药（PRKP）表型的肺炎克雷伯菌菌株。
所有的肺炎克雷伯菌菌株：CSKP(n=50)、CRKP(n=50)和PRKP(n=21)分别于2021年1月至2021年12月在中国广东省人民医院(广州医学科学院)和徐州医科大学第二附属医院临床微生物实验室从临床样本中分离得到。所有细菌均经MALDI-TOF质谱(Vitek质谱，biomassrieux, France)鉴定为肺炎克雷伯菌。用金标准肉汤微量稀释法(BMD)对所有菌株耐药性进行测定。本研究的质控菌株为大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。对于每个菌株，生成64个SERS光谱，共收集了7744张SERS光谱（平均光谱见图1），将所有光谱数据以6:2:2的比例划分为训练集、验证集和测试集，以验证模型的有效性。测试集完全独立于训练集和验证集，不参与模型的训练和验证。
为了识别三组肺炎克雷伯菌SERS光谱数据，本研究构建了CNN和CNN-attention两个深度学习模型，对细菌光谱进行分析和预测。CNN网络架构，主要由输入层、卷积层、池化层和全连接层组成，为了使CNN模型能够更准确地聚合同类型的拉曼光谱信息，引入了注意机制，并构建了CNN-attention，将注意机制与CNN连接起来，以增强模型识别重要光谱特征的能力。具体来说，在最后一个池化层和平坦层之间嵌入了自己编写的注意力函数。
使用准确率(ACC)、损失(loss)、精度(precision)、召回率(recall)和F1分数(F1)评价模型性能，除了定量评价指标外，还使用受试者工作特征(ROC)曲线来可视化模型在测试集上的性能。AUC值越大或ROC曲线的拐点越靠近左上角，则模型的性能越好。为了进一步显示模型对测试集数据的详细预测，本研究还使用混淆矩阵函数计算预测值与模型真实值的概率。
CNN和CNN-attention两种深度学习算法对CSKP、CRKP和PRKP的SERS谱数据进行分析的结果如表1所示，CNN模型的分类准确率达到98.23%，5倍交叉验证CV评分也达到96.89%，证实CNN模型能较好地区分三种不同的肺炎克雷伯菌群。在CNN模型中加入注意机制后，预测准确率提高到99.46%，表明注意机制可以进一步提高模型提取特征的能力，5倍交叉验证CV得分提高到99.90%，表明模型的鲁棒性比CNN模型更高。
为了更好地理解模型的性能，分别生成了CNN和CNN-attention模型的学习曲线和损失曲线(图2A和B)。可以看出，两种模型的训练集和验证集学习准确率接近100%，随着模型迭代次数(epoch)增加到30次，损失值达到平台期。为了了解CNN和CNN-attention模型对肺炎克雷伯菌不同群体的具体预测结果，采用混淆矩阵作为定量可视化方法，以矩阵的形式描述样本数据的真实分布与预测结果之间的关系。图2C和图D的结果表明，CNN-attention模型可以完全正确地识别测试数据集，平均识别准确率为100%，而CNN模型对CRKP和PRKP菌株的识别准确率为100%。在鉴定CSKP菌株时，1%的CSKP光谱数据被错误地鉴定为CRKP，这可能是由于两组肺炎克雷伯菌高度相似所致。
SERS技术与深度学习分析相结合，为肺炎克雷伯菌菌株的无创、低成本、可操作、快节奏诊断开辟了新的方向，具有在临床大规模常规应用的潜力，特别是在医疗资源不足的偏远地区。
