4+机器学习+单细胞+实验，干湿结合思路，简简单单操作！！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Identification of EGR1 as a Key Diagnostic Biomarker in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease (MASLD) Through Machine Learning and Immune Analysis”，这篇文章发表在J Inflamm Res期刊上，影响因子为4.2。

结果：

DEG的鉴定及免疫浸润分析

作者从基因表达综合数据库（GEO）下载了五个数据集：GSE 48452、GSE 63067、GSE 66676、GSE 89632和GSE 107231。这些数据集随后被合并和标准化。通过差异分析，作者发现了42个差异表达的基因，其中17个上调和25个下调基因。这些基因的表达模式显示在热图（图2A）和火山图（图2B）中。

各种免疫细胞群与肝细胞、星状细胞和窦内皮细胞之间的复杂相互作用在MASLD的发病机制中起着关键作用。因此，作者采用CIBERSORT算法来研究MASLD患者和健康对照之间免疫微环境的差异。作者的分析揭示了MASLD组和对照组之间22种不同免疫细胞类型的比例的改变（图2C）。图2D呈现了MASLD群组内这22个免疫细胞组之间的相关性分析。图2E显示了两组之间显著差异表达的免疫细胞类型，特别突出了MASLD组中单核细胞的富集表达。这些发现表明，免疫微环境的改变可能在MASLD的发展中起着至关重要的作用。

通过机器学习技术进行Hub基因选择

为了进一步鉴定MASLD组和对照组之间的Hub差异表达基因，作者采用了三种机器学习算法：LASSO、RandomForest和SVM-RFE（图3A-F）。作者使用Venn图来交叉由每个算法鉴定的关键基因，最终鉴定出十个枢纽基因（图3G），通过作者的分析鉴定出的十个枢纽基因如下：CYP 7A 1、PEG 10、P4 HA 1、IGFBP 2、IL 6、ME 1、NR 4A 2、VIL 1、TMEM 154和EGR 1。

外部数据集验证

在MASLD患者和对照样品之间观察到10个特征性基因的显著差异表达，表明它们在MASLD进展中的潜在关键作用。此外，进行ROC分析以评估它们的预后价值，揭示了所有基因都具有实质性的诊断效用。

为了确认这些关键基因的表达模式和诊断能力，使用外部数据集GSE 164760进行了额外的验证，包括基因表达验证和ROC曲线分析。结果表明CYP 7A 1、PEG 10和TMEM 154上调，而EGR 1、IGFBP 2、NR 4A 2和P4 HA 1下调（图4A-G）。使用验证数据集GSE 164760对枢纽基因进行进一步的ROC分析，并获得曲线下面积（AUC）值。IGFBP 2（AUC = 0.869）、NR 4A 2（AUC = 0.883）、TMEM 154（AUC = 0.836）和EGR 1（AUC = 0.882）的AUC值均大于0.83（图4 H-K），进一步证实了这些基因的强预测能力。

富集分析

基于外部验证集的AUC值，作者选择EGR1作为进一步研究的关键基因。使用R软件包“limma”，作者将MASLD组中的患者分为EGR1高表达组和EGR1低表达组。通过差异分析，共鉴定出278个差异表达基因。图5A是差异表达基因的热图，显示了具有表达差异的前40个基因。图5B显示了这40个基因之间的相关性，红色表示正相关性，蓝色表示负相关性。

随后，作者对这些差异表达的基因进行了基因本体（GO）（图5C）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）（图5D）富集分析。生物学过程分析显示，在细胞-细胞粘附、白细胞-细胞粘附、趋化性、趋化性、单核细胞分化和白细胞迁移的调节方面有显著的富集。细胞成分分析主要集中在细胞膜外侧、分泌颗粒膜、内吞囊泡、含胶原的细胞外基质、内吞囊泡膜。分子功能分析主要涉及DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II特异性、DNA结合转录激活因子活性、免疫受体活性、细胞因子结合。在KEGG富集分析中，破骨细胞分化、人T细胞白血病病毒1型感染、精氨酸-细胞因子受体相互作用、流体剪切力与动脉粥样硬化、MAPK信号通路等途径均观察到明显富集。

Hub基因的GSEA和GSVA

为了进一步研究关键基因在MASLD发病机制中的作用，作者进行了基因集富集分析（GSEA）和基因集变异分析（GSVA）。GO的GSEA显示，细胞趋化性、细胞对细菌来源分子的反应、粒细胞趋化性、白细胞趋化性、miRNA代谢过程的正调控在EGR 1的高表达组中富集（图6A）;线粒体基因表达、线粒体翻译、线粒体蛋白复合物、核糖体亚基、核糖体结构组分在EGR 1的低表达组中富集（图6 B）。KEGG的GSEA显示，趋化因子信号传导途径、丝氨酸-细胞因子受体相互作用、利什曼原虫感染、MAPK信号传导途径、toll样受体信号传导途径在EGRl的高表达组中富集（图6C）;氧化磷酸化、帕金森病、过氧化物酶体、蛋白酶体和核糖体在EGRl的低表达组中富集（图6D）。

随后，作者进行GSVA分析EGR 1高表达和低表达亚组之间的差异。在EGR 1的高表达组中（图6 E），存在几种途径的激活，包括与帕金森病、蛋白质输出、氨酰-tRNA合成、核糖体和氧化磷酸化相关的那些途径。在EGR 1的低表达组中，富集了包括朊病毒疾病、MAPK信号传导、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导和利什曼原虫感染的途径。

免疫分析

以往的研究表明，免疫微环境在MASLD的发病机制中起着至关重要的作用。为了进一步研究EGFR 1对免疫微环境改变的影响，作者分析了中枢基因高表达组和低表达组之间16种免疫细胞类型和13种免疫功能的差异（图7A）。

随后的分析探索了关键基因和免疫细胞之间的联系。如图7 B所示，EGR 1与中性粒细胞（r=0.3）和活化的肥大细胞（r=0.25）呈现显著的正相关性，与静息树突状细胞（r=-0.21）和静息肥大细胞（r=-0.31）呈现显著的负相关性。这些结果强调了EGR 1在调节多种免疫细胞相互作用中的不可或缺的作用，强调了其作为MASLD免疫相关治疗靶点的潜力。

TF-miRNA-mRNA调控网络和单细胞测序数据

从Trrust数据库检索潜在的转录因子（TF），并使用Starbase数据库鉴定候选miRNA。作者随后构建了交互网络的可视化表示（图7 C）。TF-miRNA-mRNA调控网络模拟了细胞内基因表达调控的复杂相互作用。研究这些网络对于阐明基因调控的细胞机制至关重要，这深刻影响了作者对疾病过程的理解和创新治疗方法的发展。在图中，绿色框代表转录因子（TF），蓝色框代表microRNA（miRNAs），它们是短的非编码RNA分子。

通过对单细胞数据集GSE 159977的分析，作者鉴定了关键基因在四个不同细胞亚型中的分布（图7D）。具体地，对于关键基因EGRl，作者观察到对照组和MASLD组之间单核细胞的显著差异（图7E）。

通过体内和体外实验验证

作者建立了小鼠脂肪肝细胞模型。使用油红O染色，作者观察到与正常对照组相比，PA组中脂滴显著积聚（图8A）。PCR分析表明PA组中EGR1表达水平显著降低（图8B）。在蛋白质水平，EGFR 1也显著降低（图8C和D）。作者进一步验证了关键基因在动物模型中的表达水平。与对照组相比，喂食MCD饲料的小鼠的肝组织切片在H&E和油红O染色中表现出明显的炎症和气球样变性，并伴有大量脂滴蓄积（图8E）。此外，这些小鼠中总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的血清水平显示出显著的变化（图8F和G），证实了模型的成功建立。

随后，作者测量了肝组织中促炎细胞因子的表达水平。观察到CCL 2、IL-1β和TNF-α水平的显著变化，而IL-6水平保持不变（图8H）。小鼠肝组织中EGR 1的相对mRNA水平显示出显著降低（图8I），相应的蛋白质水平显示出显著差异（图8 J和K），与先前的发现一致。

总结

在这项研究中，通过差异基因表达（DEGs）分析和机器学习技术，作者成功地确定了10个枢纽基因。其中，使用外部数据集验证并筛选了关键基因EGR1，曲线下面积（AUC）为0.882。富集分析和免疫浸润评估揭示了涉及EGR1在MASLD发病机制和进展中的多个途径，显示出与各种免疫细胞的显著相关性。此外，额外的细胞实验和动物模型验证证实了EGR1的表达趋势与作者的分析结果高度一致。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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