嘿，这里是馆长，今天一看日历，居然立秋已过，各位宝子们有没有收到秋天的第一杯奶茶呢（比奶茶更重要的是，希望天气如节气名字一样秋天到来），没有收到也没有关系，馆长送你一个超绝的分析思路~
单细胞测序作为科研界的“当红炸子鸡”咱们也是有所耳闻的，而机器学习作为发文神器更是斩“文”无数，聪明的宝子们肯定猜到了，馆长今天带来的文章便是单细胞测序+机器学习。南方医科大学南方医院房付春团队使用单细胞测序发现NETs相关的基因，并基于此利用机器学习进行预测模型构建，最终五张主图一举拿下11.4分一区TOP！生信分析方面还是比较常规的，下面一起跟随馆长的脚步来学习吧！
1、多组学数据整合与机器学习的应用：结合了单细胞测序和批量转录组测序数据（转录组四处碰壁？不妨尝试加入单细胞数据），并使用WGCNA来识别共表达基因模块，此外采用6种机器学习算法构建牙周炎预测模型，并通过交叉验证方法提高了模型的稳定性和泛化能力。
2、细胞间通讯分析与实验验证：运用CellChat和NicheNet软件包探索了细胞间的配体-受体交互作用，通过体外实验验证了特定中性粒细胞亚群与NETs形成的关系，最后使用实时定量PCR对scRNA-seq数据中的关键基因表达进行了验证（干湿结合，更受到审稿人青睐）。
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题目：人牙龈单细胞图谱揭示了NETs相关的调节牙周免疫的嗜中性粒细胞亚群
杂志：Journal of Advanced Research
影响因子
：IF=11.4
发表时间：2024年07月30日
研究背景
中性粒细胞是口腔屏障组织中最丰富的先天免疫细胞，对维持牙周免疫稳态至关重要。然而，中性粒细胞的过度招募或激活会导致牙周微生物群与宿主免疫反应之间的失衡，最终可能引发牙周炎。尽管在某些基因突变相关的患者中，中性粒细胞的缺乏或功能缺陷与严重牙周炎的早期发展有关，但中性粒细胞如何促进牙周病的病理过程尚不完全清楚。
研究思路
研究者通过单细胞RNA测序技术深入分析了牙周组织中中性粒细胞的异质性，并首次定义了与中性粒细胞胞外捕获器（NETs）相关的中性粒细胞亚群（NrNeu）。进一步通过体内实验验证了NETs在牙周炎发展中的作用，并利用机器学习技术构建了基于关键NETs相关基因的牙周炎预测模型。此外还探讨了牙龈成纤维细胞通过特定信号轴促进NrNeu亚群形成NETs的分子机制，旨在为牙周炎的临床诊断和治疗提供新的理论和实践依据。下面为研究流程图：
数据来源
数据集 | 数据库 | 数据类型 | 详细信息 |
GSE16134 | GEO |
scRNA-seq | 包括69个健康样本和241个牙周炎样本。这些样本被随机分为训练集和验证集，其中训练集包括48个健康样本和169个牙周炎样本，验证集包括21个健康样本和72个牙周炎样本。 |
主要结果
1.人牙龈组织的单细胞图谱
研究者通过scRNA-seq技术对来自3名健康个体和3名确诊为牙周炎患者的牙龈组织样本进行了分析。经过质量控制筛选后（图1A），利用UMAP技术鉴定出了九种主要的细胞群体（图1B）。通过热图展示了与每种细胞群体相关的标记基因表达水平（图1C）。随后比较了牙周炎组与健康组之间各个细胞群体的表达变化差异（图1D）。结果显示，在牙周炎中，基质细胞、上皮细胞和肥大细胞显著减少，而浆细胞、B细胞和中性粒细胞显著增加。进一步通过免疫荧光染色确认了人类和小鼠牙周炎牙龈组织中中性粒细胞浸润的增加（图1E）。（ps：这里直接用免疫荧光染色对中性粒细胞浸润情况进行验证，并抓住中性粒细胞这一点进行后续的分析）
图1 人牙龈组织的单细胞图谱
2.通过中性粒细胞异质性分析鉴定Nets相关亚群
研究者进一步将中性粒细胞细分为四个亚群：N0、N1、N2和N3。与健康组相比，牙周炎组中N3亚群显著减少（ps：图2A右，可以看出N3亚群数量极少），而N0、N1和N2亚群增多，尤其是N0亚群（图2B）。通过WGCNA鉴定了与这些亚群相关的基因模块，发现蓝色模块基因在N0亚群中高度表达，且与NETs形成途径显著相关（图2F）。拟时序分析揭示了从健康状态到牙周炎状态中性粒细胞亚群的变化，其中NrNeu（N0）和ANeu（N2）亚群可能在牙周炎的发展有密切关系（图2H）（ps：这里研究的重点从亚群转移到NETs）。
图2 通过中性粒细胞异质性分析鉴定 NETs 相关亚群
3.NETs促进牙周病的免疫病理学变化
研究者使用DNase I（ps：是一种已知的NETs抑制剂）对对照组和实验性牙周炎（LIP）小鼠进行了处理（图3A）。通过免疫荧光分析发现与健康对照小鼠相比，LIP小鼠的上颌组织中NETs标记物表达显著增加；而在DNase I处理的LIP小鼠组中，与对照组相比，这些标记物的表达明显减少，表明NETs被抑制（图3B）。
HE染色显示，在抑制NETs后，LIP小鼠的牙龈组织炎症细胞浸润和附着丧失减少（图3C）。此外，DNase I处理显著降低了LIP小鼠牙龈炎症因子的表达（图3D），表明
NETs能够调节局部炎症反应。Micro-CT分析表明，抑制NETs减轻了LIP小鼠的牙槽骨吸收（图3E和F）（ps：通过这两种实验，成功验证了NETs的功能）。
图3 NETs促进牙周病的免疫病理学变化
4.基于NETs相关的基因（NrGs）构建牙周炎的预测模型
研究者首先通过联合分析在牙周炎中NrGs的差异表达基因以及GSE16134数据集中确定的牙周炎相关基因，然后通过Lasso回归和多因素逻辑回归，最终筛选出三个关键基因（图4B和C）（ps：抓住NETs这一点，于是找到其相关基因，并着重开始构建预测模型）。随后采用六种机器学习算法构建了牙周炎预测模型。在模型构建过程中，使用了k折交叉验证（k=5）来增强模型的稳定性。内部验证和外部验证结果表明模型具有很好的泛化能力（图4D,E,G）。此外，通过scRNA-seq数据和临床牙龈样本验证了这三种关键基因在牙周炎中的上调表达（图4H和4I）。（ps：通过外部数据集进行验证，增加模型可信度）
图4 基于NETs相关的基因构建牙周炎的预测模型
5.牙周炎牙龈成纤维细胞通过MIF-CD74/CXCR4增强NrNeu形成Nets
研究者通过细胞间通讯分析
发现成纤维细胞对NrNeu的影响最为显著，表明成纤维细胞可能促进NETs的形成（图5A-C）。
为了验证这一点，使用条件培养基刺激中性粒细胞，结果显示PGFs CMed导致更多的细胞死亡和NETs产生（图5D和E）。随后应用配体活性预测来寻找配体及其下游目标基因，结果发现MIF是参与NrNeu调节的首要候选因子（图5F）。实际上，MIF在牙周炎成纤维细胞中的表达上调，这在PGFs中也有所观察（图5H）。进一步分析显示MIF的受体包括CD74、CXCR4和CXCR2（图5G）。（ps：研究者随后将重心放在细胞通讯，探索NETs的形成原因，增加研究的深度）
图5 牙周炎牙龈成纤维细胞通过MIF-CD74/CXCR4增强NrNeu形成Nets
文章小结
作者首先通过单细胞分析确认牙周炎组哪些群体存在表达差异，随后通过免疫荧光确认中性粒细胞浸润增加。进一步将主角中性粒细胞细化分群，并进行WGCNA分析，从而定义了一种新型的亚群NETs，再增加实验验证该亚群的功能。据此认为该亚群是有效的，并根据NETs相关基因构建预测模型（发文神器+1，增加实验广度），随后又进一步通过细胞通讯深度探索NETs的形成原因（增加实验深度），总的来说前面分析思路还是比较固定的，换个疾病，如果能找到很好的亚型，也是可以研究起来的。有想做相似类型研究的小伙伴却无从下手的宝子吗，或者手中有数据却不知如何分析，想定制个性化分析方案，欢迎来找馆长交流想法，这里还有一大波高分文章套路可复现！
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