【一百六十三篇】基于深度学习的光谱分析快速鉴定尿路致病菌耐药性

尿路感染是人类最常见的一种获得性疾病，尿路多药耐药(MDR)病原体的患病率在全球范围内呈上升趋势，每年影响约1.5亿人。中游尿液培养鉴定病原体是临床诊断尿路感染的金标准，但所需时间长，在细菌药敏试验结果尚未确定之前，感染患者往往使用广谱抗生素，加剧了抗生素耐药性在尿路感染中的传播，因此，快速准确地鉴定引起尿路感染的细菌及其抗生素敏感性，对于有效治疗尿路感染至关重要。

细菌总是带负电荷。在本研究中，提出了一种充满带正电的金纳米颗粒的平面固体SERS衬底，通过静电吸引紧密捕获其表面的病原体，从而提高拉曼光谱分析的信噪比。然后，利用CNN算法构建不同微生物的SERS光谱识别模型，对细菌种类、抗生素敏感性和MDR细菌进行分类，并与传统统计分析方法进行比较。

选取占临床尿路感染病原菌的90%以上6种微生物（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、神奇假单胞菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌）共18株进行分析。6个标准菌株(ATCC25922、ATCC43816、ATCC35659、ATCC27853、ATCC29212、ATCC12228)购自广东省微生物采集中心，3种临床耐多药菌(大肠杆菌5株、铜绿假单胞菌5株、粪肠杆菌2株)由东莞市东华医院临床微生物室提供。分别测定了6株标准化菌株和12株临床MDR菌株的SERS光谱。为了尽量减少由于同一物种的细胞异质性和生理状态造成的偏差，每个样品测量了3000个光谱，总共测量了54,000个光谱，如图1。在构建CNN模型时，70%的SERS光谱数据集用于训练，20%用于验证，10%用于测试。

CNN由4个卷积层、4个最大池化层和2个完全连接层组成(图2)。第一层和第二层卷积层的滤波器数量为8个，最后两层卷积层的滤波器数量为16个。两个卷积层的核大小都是3×3，池化层使用最大池化。最后，使用步长为2的卷积对数据进行聚合，并通过两个完全连接的层分别获得128和18个神经元的输出。输入层是尿路感染六种病原菌的SERS光谱，CNN利用卷积层从输入光谱中提取特征，将得到的特征映射传递到下一层，最后传递到全连接层。在每个卷积层中，使用校正后的线性元素作为激活函数来解决非线性分类问题，模型的最终输出由10倍交叉验证提供。

利用CNN对6种细菌的SERS光谱进行物种识别，每种细菌共3000张SERS光谱，建立物种数据库。对于部分含有MDR菌的菌型，按照等数原则，随机选取每株菌相同数量的SERS谱，以保证每种病原菌的SERS谱总数为3000张。然后将这些数据用于训练和测试CNN物种识别模型，其平均识别准确率为97.8±1.4%(图3a)。P. aeruginosa的鉴定准确率最低，为95.8%，其中大部分被误认为粪肠杆菌和大肠杆菌。对于大肠杆菌，也存在粪肠杆菌和铜绿假单胞菌的错误分类，这可能是由于铜绿假单胞菌中的一些耐多药菌与其他类型的细菌光谱相似所致。

以上结果表明，所建立的CNN模型可以通过SERS光谱分析准确识别不同的细菌。此外，还将CNN模型与一些典型的数据分析方法进行了比较，以分析和识别相同的数据。结合主成分分析和KNN算法构建分类识别模型PCA-KNN的平均分类准确率为85%，低于CNN，说明CNN算法是细菌SERS光谱分类识别的最佳模型。

利用CNN对大肠杆菌、粪肠杆菌和铜绿假单胞菌的敏感和耐药菌株进行SERS谱鉴定。为每一种细菌建立独立的分类模型，检验CNN是否能够识别引起尿路感染的致病菌的药敏。如图3b所示，大肠杆菌、粪肠杆菌和铜绿假单胞菌的检测准确率均在95%以上，表明所建立的方法具有较高的准确性。其中粪肠杆菌的检测准确率为100%。这可能与粪肠杆菌的形状和大小有关，粪肠杆菌呈球形，具有球对称，尺寸一般小于1 μm，小于物镜焦斑直径。因此，在测量中，与其他细菌相比，我们更容易获得粪肠杆菌完整个体的SERS光谱，其波动范围窄，重现性好。

在这项工作中，还分别使用CNN训练和测试了三种MDR菌株的SERS光谱分类模型。大肠杆菌5株，铜绿假单胞菌5株，粪肠杆菌2株，均有3000个SERS光谱。上述12株菌株均表现出不同程度的抗生素耐药，图3c为分类和识别结果，其中粪肠杆菌的平均识别准确率最高，为100%，大肠杆菌的平均识别准确率次之，为99%，铜绿假单胞菌的平均识别准确率最低，为97%。

本研究在获得SERS谱后，应用CNN算法构建高灵敏度识别模型，对尿路感染细菌进行物种、药敏、多药耐药三个层次的逐步分类。该方法既能鉴定病原菌的药敏，又能鉴定病原菌的多药耐药情况，对临床用药具有重要的参考价值。

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