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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“A High Immune-Related Index with the Suppression of cGAS-STING Pathway is a Key Determinant to Herceptin Resistance in HER2+ Breast Cancer”，这篇文章发表在Int J Biol Sci期刊上，影响因子为8.2。

结果：

I 型 IFN 信号转导的下调与 HER2+ BC 患者的不良预后相关

为探讨HER2靶向治疗如何改变HER2+ BC的特征，从03-311试验中获取HER2+ BC患者的RNA表达和相应的临床数据GSE76360队列。在基线和短暂暴露于单药赫赛汀后对肿瘤活检进行RNA表达谱分析，这可以排除其他治疗干扰（图1A).

首先，为了发现与 HER2+ BC 预后最相关的基因模块，使用一剂赫赛汀治疗后 HER2+ BC 患者的表达谱进行 WGCNAGSE76360队列（图1A）。软阈值功率值设置为6，用于后续分析（图S1A）。进行动态模块鉴定，将5个共表达模块聚类，蓝色模块与临床反应呈最强正相关（Cor = 0.45，p < 1e-200）（图1B-D，图S1B）。通过GO富集检验蓝色模块中总基因的潜在功能。结果包括对免疫系统过程的调节，包括白细胞介导的免疫、白细胞间粘附和免疫细胞活化的调节。此外，还使用来自GSE76360队列。进行动态模块鉴定，将4个共表达模块聚类（图S1D），蓝色模块与临床反应呈最强的正相关（图S1E）。通过GO富集检验蓝色模块中总基因的潜在功能。结果包括几种免疫相关通路，包括Fc受体信号通路（p值=0.0057）、髓系白细胞迁移（p值=0.0139）和巨噬细胞衍生的泡沫细胞分化（p值=0.0141）。上述结果表明，免疫相关信号转导与HER2+ BC的预后呈正相关（图1E，图S1D-E）。

然后作者研究了抗HER2治疗对HER2+ BC免疫微环境的影响。确定了一剂赫赛汀治疗（Biopsy-2）之前和之后的 DEG 以在GSE76360根据治疗反应进行队列。结果显示，赫赛汀治疗后pCR患者明显激活了许多免疫相关的生物过程，如白细胞脱颗粒、髓样细胞活化和肥大细胞介导的免疫（图1F），而多种免疫相关通路，如IFN信号转导，包括IFN-α反应通路和IFN-γ反应通路，在无反应的患者中下调（图1G，图S1C）。作者还研究了赫赛汀治疗后无反应患者肿瘤微环境景观的变化。xCell算法估计的肿瘤微环境成分表明，无反应患者靶向治疗后肿瘤免疫细胞浸润率和评分呈下降趋势，但无统计学意义（图1H）。总而言之，免疫相关信号传导，尤其是I型IFN信号传导，在HER2靶向治疗后预后不良的HER2+ BC患者中会下调。

构建 HER2+ BC 的免疫相关预后指数（IRPI）

为了充分考虑肿瘤的免疫浸润并更好地选择可能从赫赛汀治疗中受益的 HER2+ BC 患者，构建了 IRPI 以进一步分层。指标构建流程如图所示图2A.首先，通过低剂量赫赛汀处理（5μg/ ml）建立赫赛汀耐药HER2 + BC细胞系超过6个月（图S2A;图 S3A).

菌落形成试验表明，随着培养基中赫赛汀的增加，亲本MDA-MB-453/SKBR3细胞的菌落形成能力受到显着抑制，而耐药MDA-MB-453/SKBR3细胞的菌落形成能力在相同条件下没有降低（图S2B-C）。对MDA-MB-453细胞系进行RNA序列，鉴定亲本和耐药MDA-MB-453细胞系之间的DEGs。其次，赫赛汀治疗前后DEGs的交集GSE76360来自MDA-MB-453细胞系的队列和DEG显示在维恩图中（图2A）。获得244个候选基因，其中96个上调，148个下调（图2A）。使用包含85个HER2+ BC样本的TCGA队列和OS信息进行预后模型构建。244 个候选基因中有 25 个使用单因素 Cox 回归分析与 OS 显著相关。Bagaev等人已经确定了四种TME亚型（MFP亚型），它们在不同的癌症中是保守的，并且与免疫治疗反应相关28.在作者的研究中，应用XGBoost算法根据该MFP亚型鉴定了83个免疫相关基因（图S2G）。这两个输出的交集包括 8 个基因（图2A）。最后，使用TCGA HER2+ BC队列通过Lasso Cox回归分析最终构建了3基因特征（CDADC1，ENC1，PIM1）（图2A，图S2D-F）。每位患者的 IRPI 评分使用以下公式计算。IRPI_score = （0.297944181 * CDADC1 exp.） + （0.004639381 * ENC1 exp.） - （0.046579753 * PIM1 exp.）。如图所示图2A，CDADC1 和 ENC1 是危险因素，而 PIM1 是保护因素。

接下来，作者在 TCGA HER2+ BC 队列中验证了作者的预后模型的预测能力。OS的ROC曲线下时间依赖面积（AUC）在1年时达到0.89，在3年时达到0.78，在5年时达到0.82，而PFS的时间依赖性AUC在1年时达到0.81，在3年时达到0.80，在5年时达到0.83（图2B）。此外，HER2+ BC患者以中位IRPI评分为临界值，分为高IRPI组（n = 42）和低IRPI组（n = 43）（图2C）。高IRPI患者的死亡概率高于低IRPI患者（图2D）。Kaplan-Meier分析还显示，高IRPI患者仅在HER2 + BC中具有较差的OS，而在其他BC亚型中没有（图2E-F）。更重要的是，通过多因素Cox回归将IRPI确定为临床特征中的独立预后因素（图2G）。在外部验证队列中，作者进一步评估了 IRPI 与 HER2+ BC 赫赛汀耐药性之间的关联。HER2+ BC远处转移的IRPI明显高于原发性BC的IRPIGSE191230队列（图2H）。此外，赫赛汀耐药MDA-MB-453的IRPI显著升高（图2I）。2共同构建免疫相关指数（IRPI）以有效预测HER2+ BC的预后，该指数与赫赛汀耐药性高度相关。

高 IRPI 的 HER2+ BC 患者具有抑制性免疫微环境景观

为了探究IRPI与TME的关系，采用TCGA HER2+ BC队列中高低IRPI组的DEGs进行基因集富集。结果显示，在高IRPI患者中，IFN信号转导，尤其是I型IFN反应通路下调（图3A）。这些DEGs富集的功能模块还包括网络图所示的IFN-α响应通路（图3B）。由于临床前和临床研究已经证实了IFNs对恶性细胞的有效宿主免疫反应的重要作用，作者通过xCell算法进一步筛选了TCGA HER2+ BC队列，以探索IRPI与TME的关系。如图所示图3C，IRPI低患者免疫评分和基质评分较高。详细来说，低IRPI患者癌症相关成纤维细胞、巨噬细胞、M1巨噬细胞、B细胞、记忆B细胞、幼稚B细胞、类别转换记忆B细胞、髓样树突状细胞、活化髓样树突状细胞、CD4+ T细胞（非调节性）、效应记忆CD4+ T细胞、记忆CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、中央记忆CD8 + T细胞和效应记忆CD8 + T细胞（图3C）。在癌症免疫周期中，IRPI水平与免疫细胞，特别是CD8+ T细胞、Th1细胞和NK细胞的浸润显著相关（图3D）。作者的结果还表明，与其他MFP亚型相比，免疫富集/非纤维化（IE）亚型的IRPI水平最低28（图3E）。同时，研究了IRPI与几个关键ICM之间的相关性。低IRPI组PD-L1、CTLA4、IDO1、HAVCR2、LAG3等ICMs的表达水平均高于高IRPI组（图3F-J）。以上结果证实，IRPI高的HER2+ BC患者具有抑制性肿瘤免疫微环境。

scRNA-seq 分析显示 I 型 IFN 反应通路在高 IRPI 的肿瘤细胞中下调

为了进一步探讨IRPI与抗肿瘤免疫格局的关系，作者分析了4个原发性HER2+ BC的scRNA-seq数据。GSE176078队列。这4例患者根据其对应的批量RNA序列数据分为两组，其中CID4066和CID3921属于高IRPI组，CID3838和CID3586属于低IRPI组。在进行质量控制分析后，共使用经典谱系标记注释了16,803个单细胞（图 4A-B）。UMAP可视化显示，高IRPI组的间充质细胞浸润率较高，而低IRPI组的肿瘤T细胞浸润率较高（图4C-D）。为了区分肿瘤细胞，上皮细胞的UMAP可视化被重新聚集（图4E）。作者使用“inferCNV”R 包估计 CNV 配置文件。结果显示，簇0、5、7和8具有较高的CNV，它们被认为是肿瘤细胞（图4F）。接下来，肿瘤细胞中高IRPI和低IRPI之间的DEGs富集分析表明，同种异体移植物排斥通路、G2M检查点通路以及最重要的I型IFN反应通路在高IRPI肿瘤细胞中均下调（图4G）。此外，I型IFN反应通路在高IRPI BC的其他非肿瘤细胞中未下调（图4H).

cGAS-STING 信号转导在赫赛汀耐药的 HER2+ BC 中失活

上述生物信息学分析表明，高IRPI的HER2+ BC患者在肿瘤细胞中IFN反应通路下调，对赫赛汀表现出耐药性。接下来，作者使用已建立的赫赛汀耐药细胞系（包括 MDA-MB-453 和 SKBR3）进一步证实了这一分析。富集分析显示，与亲本细胞系相比，I型IFN反应通路，尤其是IFN-α反应通路在耐药MDA-MB-453细胞系中主要下调（图5A）。IFN-α反应通路在有效抗肿瘤免疫所需的先天免疫系统中起着关键作用29.正如预期的那样，在耐药菌株中，IFN-α信号转导的核心上游蛋白TBK1的激活受到抑制（图5B）。由于来自垂死细胞和细胞质DNA片段的RNA可能会诱导肿瘤中内源性IFN系统的强大激活，作者接下来评估了这些核酸的感知途径是否在耐药细胞中发生了改变。作者将双链RNA（dsRNA）或鲱鱼睾丸DNA（HT-DNA）转染到亲本细胞和耐药细胞中。结果显示，dsRNA转染显著提高了抗性细胞中IFNB1 mRNA和下游ISGs mRNA的表达，这与亲本细胞相似（图5C-D）。相比之下，HT-DNA转染只能增加亲本细胞中IFNB1 mRNA和ISGs mRNA的表达，而不能增加耐药细胞中的表达（图5E-F）。作者进一步检测了亲本细胞和赫赛汀抗性细胞的细胞质中微核的强度。结果表明，抗性细胞系在细胞质中具有较高的微核强度（图S3C）。此外，cGAS蛋白的表达在亲本细胞和耐药细胞之间没有显著差异（图S3 B）。然后，作者通过ELISA测量了细胞内cGAMP水平，发现在HT-DNA处理后，cGAMP在亲本细胞中可以显着增加，但不能在抗性细胞中增加（图 5G）。这些结果表明，cGAS-STING通路是感知胞质DNA和激活IFN信号传导的主要先天免疫通路，可能在耐药细胞中被抑制。由于IRF3是cGAS-STING通路的关键转录因子30，作者接下来检查了 IRF3 的亚细胞定位。通常，IRF3主要存在于细胞质中。实际上，IRF3在亲本细胞中暴露于HT-DNA后被转移到细胞核中（图5H）。相比之下，当用HT-DNA处理时，耐药细胞中IRF3向细胞核的易位显着减少（图5H，图S3D）。为了评估 HER2+ BC 样本中 cGAS-STING 信号转导的临床意义，本研究选择了 126 个具有可用随访数据的人 HER2+ BC 病变的石蜡块（表 S2）。通过IHC评估核IRF3的蛋白质水平（图S3E）。Kaplan-Meier生存分析显示，核IRF3高表达患者的OS比低表达组患者更长（图5I）。总体而言，这些结果表明 cGAS-STING 信号传导在赫赛汀耐药的 HER2+ BC 中被抑制。

STING激动剂激活IFN信号转导可逆转赫赛汀耐药HER2+ BC中的cGAS-STING通路活性

cGAS-STING通路的激活促进了I型IFN的转录，并且之前在许多临床前模型中报道了促进抗肿瘤免疫31-33.由于耐药细胞中HT-DNA处理下调了cGAMP的产生，作者进一步用cGAMP处理耐药细胞，发现cGAMP可以显着增加耐药细胞中TBK1的磷酸化，就像在亲本细胞中一样（图6A).

多种STINGa已被批准用于临床试验34,35.ADU-S100 是 STINGa 之一，是一种合成的环状二核苷酸，可激活 cGAS-STING 通路35.作者试图检查ADU-S100是否可以重新激活耐药细胞中的IFN信号传导。结果表明，ADU-S100可以显著增加亲本细胞和抗性细胞中TBK1的磷酸化（图6B）。此外，ADU-S100可以部分重新激活耐药细胞中ISGs的mRNA表达（图6C）。由于IFN信号的激活对于抗原呈递和抗肿瘤免疫至关重要19，作者分析了STINGa处理后耐药细胞抗原呈递能力的变化。与亲本细胞相比，抗原呈递中参与抗原呈递的基因的mRNA水平在耐药细胞中显著降低，但可以通过ADU-S100干预来恢复（图6D）。在细胞表面表达的MHC-I是肿瘤抗原呈递机制的关键组成部分之一，是T细胞识别和杀伤不可或缺的19,36.与mRNA水平的结果一致，与亲本细胞相比，作者在耐药细胞中检测到较低水平的MHC-I，并且在通过流式细胞术处理ADU-S100后，耐药细胞中MHC-I水平升高（图6E）。综上所述，这些结果表明，STINGa可以诱导赫赛汀耐药HER2+ BC中cGAS-STING通路的稳健再激活。

STINGa 和 DS-8201 的组合增强免疫监视，以抑制赫赛汀耐药 HER2+ BC 的肿瘤生长

越来越多的证据表明，DS-8201 是赫赛汀耐药的 HER2+ BC 患者的标准治疗3.作者证明了 STING 信号转导在赫赛汀耐药的 HER2+ BC 中具有抑制性，并且 STINGa 可以释放 I 型 IFN 反应通路的激活。因此，作者推测DS-8201和STINGa的组合在PBMC存在下可能具有协同抗肿瘤作用。作者首先研究了单独使用ADU-S100在亲本细胞和耐药细胞中的作用。有趣的是，尽管ADU-S100增加了亲本细胞和耐药细胞的细胞死亡，但单独使用ADU-S100增加了亲本细胞中的细胞死亡，而不是耐药细胞中的细胞死亡。但与PBMC的共培养实验表明，单独使用ADU-S100仅在赫赛汀耐药的SKBR3细胞中促进癌细胞的死亡，而在亲本细胞中则不促进癌细胞的死亡（图7A）。作者进一步研究了STINGa是否与DS-8201具有协同抗肿瘤作用。正如预期的那样，与PBMC的共培养实验表明，与单独使用DS-8201或ADU-S100相比，DS-8201和ADU-S100在赫赛汀耐药细胞中的抗肿瘤功效显着增加，但在亲本细胞中则没有（图7A）。为了验证DS-8201和STINGa在体内的联合作用，作者在携带赫赛汀耐药肿瘤的免疫缺陷NCG小鼠中对其进行了测试，并用人类同种异体PBMCs重组。将赫赛汀耐药的SKBR3细胞皮下注射到NCG小鼠体内。一旦建立肿瘤异种移植物（约30mm3），静脉注射人PBMC（第0天），并按照指示用DS-8201和ADU-S100治疗小鼠（图7B）。与体外观察结果一致，用 DS-8201 或 ADU-S100 治疗的效果最小，但 DS-8201 和 ADU-S100 的联合使用显着改善了肿瘤生长抑制和协同抗肿瘤作用（q = 1.21），异种移植肿瘤体积和肿瘤重量的生长曲线证实了这一点（图7C-E）。作者研究了这种联合治疗策略对抗肿瘤免疫的影响。事实上，联合治疗导致CD8 + TIL群体增加（图7F）。与单一DS-8201治疗相比，联合治疗还导致GZMB释放增加（图7G）。为了进一步证实这一现象，还进行了免疫荧光测定以确定GZMB的释放。结果与IHC测定的结果相似（图7H，图S4B）。此外，为了分析cGAS-STING信号表达与DS-8201细胞毒性之间的关系，异种移植肿瘤切片中磷酸化TBK1的水平见图7B采用免疫荧光法检测。结果显示，与对照组和DS-8201治疗组相比，ADU-S100治疗组和联合治疗组EpCAM+异种移植肿瘤细胞中TBK1的磷酸化率要高得多（图7I，图S4C）。在实验过程中，在小鼠中没有观察到一般情况的异常。测量不同组小鼠的体重。结果显示，治疗组和对照组的体重差异无统计学意义（图7J），表明联合治疗对小鼠无明显毒性作用。总之，这些数据表明，STINGa有可能在体内增强DS-8201在赫赛汀耐药HER2+肿瘤中的疗效。

总结

总之，作者阐明了一种新的免疫相关指数（IRPI），用于赫赛汀治疗的 HER2+ BC 患者的预后。作者阐明了 cGAS-STING 通路是高 IRPI 赫赛汀耐药 BC 免疫逃逸的关键决定因素。在赫赛汀耐药的HER2+ BC中使用STINGa可以逆转IFN信号传导活性，从而促进抗肿瘤免疫反应，并在体外和体内与DS-8201具有协同抗肿瘤作用。

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