今天为大家介绍的是来自California Davis大学Oliver Fiehn团队的一篇论文。了解吸入毒物的区域性反应对理解在空气污染暴露下的肺部疾病发病机制至关重要。作者评估了过敏原致敏和臭氧暴露的联合效应，如何引起小鼠肺部脂质分布的空间差异，这可能导致哮喘中臭氧诱导的加重。作者通过应用已建立的机器学习算法，展示了对高分辨率质谱成像数据进行标准化和分割的能力。有趣的是，作者的分割区域与组织学验证的肺区域重叠，使得能够在生物重复样本间进行区域分析。作者的数据揭示了空间上不同脂质（lipid）丰度（abundance）的差异，支持脂质饱和度在健康肺功能中的潜在作用，并且强调了臭氧暴露后区域性肺脂质分布的性别差异。作者的研究为未来的质谱成像实验提供了框架，这些实验能够在生物重复样本之间进行相对定量，并扩展到多种样本类型，包括人体组织。
美国有超过1.37亿人生活在空气污染水平不健康的地区。暴露于空气污染的主要成分，包括颗粒物和氧化性气体，它们恶化现有肺部疾病和可能导致新发呼吸系统疾病的能力已被充分表征。尽管对吸入毒物的急性和慢性不良健康结果进行了广泛评估，但这些影响的分子机制仍未被充分理解。重要的是，先前的研究已表明，颗粒物和氧化性气体如臭氧（O₃）会引起特定部位的毒性，这取决于毒物的物理化学特性及其吸入浓度。值得注意的是，臭氧暴露对导气道的区域特异性影响已被充分研究，它急性诱导气道高反应性、气道炎症，并损害肺表面活性物质。臭氧暴露也是加重人类既有哮喘的已知风险因素，尽管可能解释这种关联的潜在机制尚未被充分理解。使用结合臭氧和常见人类过敏原（如屋尘螨（HDM））的综合暴露模型可能阐明臭氧诱导哮喘加重的机制。
除了吸入毒物的区域特异性影响外，肺内细胞类型的广泛多样性、外源物质代谢的差异以及呼吸道上细胞群体分布不均等因素，都导致影响常常局限于个别细胞类型或肺区域。高分辨率空间代谢组学研究对于在吸入毒物暴露后肺内基因表达下游的功能变化背景化是必要的。
质谱成像（MSI）展示了促进高空间分辨率代谢组学分析的潜力。MSI最近已被应用于各种场合，以评估肺部接近单细胞分辨率和其他组织类型中单细胞分辨率的脂质和代谢物的定位。尽管MSI数据获取的技术有所进步，但专门用于大规模代谢组学或脂质组学研究的MSI数据处理和分析仍然具有挑战性,用于探索MSI数据集的工具相对较少，突显了对额外资源的需求，特别是能够在生物重复样本之间执行MSI数据分析的软件。
包括生物重复样本被认为是扩大MSI研究范围的必要条件。然而，目前在MSI实验中跨生物重复样本进行统计分析的能力仍然有限。同样，将先前开发的分割方法应用于肺组织特别困难，这是由于与MSI常分析的组织类型（如脑或肾组织）相比，肺的形态特征独特。
作者的本研究通过提供全面、多功能的分析脚本来比较研究组间的生物重复样本，从而解决了肺组织MSI研究中的这些差距。其次，作者应用MSI分析工作流程，在形态学相关肺区域中以高空间分辨率确定急性臭氧暴露对过敏性哮喘小鼠模型中肺脂质的影响。最后，作者先前研究与MSI研究结果之间的比较强调了与大块解剖组织的LC-MS/MS相比，可以从MSI获得的详细空间信息。
作者先前已报告了联合屋尘螨/臭氧暴露对小鼠肺部生理学和显微解剖肺气道和实质脂质组学特征的影响。作者之前的研究表明，雄性小鼠表现出协同增加的气道高反应性和气道炎症，而这在雌性小鼠中没有观察到。由于单独的屋尘螨或臭氧对显微解剖组织中的全球脂质丰度的影响相对温和，作者目前的MSI研究仅关注联合屋尘螨/臭氧暴露的影响。因此，作者比较了六只接受屋尘螨/臭氧暴露的小鼠肺部与六只对照肺部，每组中各有三只雄性和雌性。作者在此通过H&E染色确认了屋尘螨/臭氧暴露肺部与对照肺部相比的主要结构变化。具体来说，联合屋尘螨/臭氧导致雄性小鼠与雌性小鼠相比气道炎症增加，这表现为与对照处理小鼠相比气道上皮的增厚。与作者先前分析甲醛固定和石蜡包埋的H&E切片的研究相比，琼脂糖充气肺切片的H&E染色通常对获取详细的形态学见解信息量较少。然而，H&E染色切片仍然适合确认与作者MSI数据相对应的特定位置特征。
对于每个约0.2 cm²的肺切片，使用10 μm光栅在切片上进行正负离子模式质谱成像，产生高达10 GB的MSI文件。作者最初将所有原始数据文件导出到SCiLS软件中以转换为imzML格式。所有导出的imzML文件的处理和分析都在R v.4.3.3中完成，使用了综合分析脚本，这些脚本利用了来自15个以上单独R包的函数，作者将其开发为一个独立的R包，名为RegioMSI。峰检测、分箱和对齐由Cardinal R包完成，该包允许同时处理多个实验运行中的所有峰。通过同时处理所有样本，在对谱图进行分箱用于后续峰注释后，作者获得了12个正模式切片约1100个峰和12个负模式切片700个峰的单一对齐列表。
作者通过基于LC-MS/MS的非靶向脂质组学验证从MSI数据获取后刮取的ITO幻灯片上的组织，或通过将m/z值与作者先前在相同实验条件下处理的显微解剖肺组织的非靶向脂质组学数据匹配，为检测到的峰分配注释。作者没有评估基质应用对LC-MS/MS中脂质检测的影响，尽管先前的报告表明，LC-MS/MS鉴定的脂质数量不受基质沉积的显著影响。匹配的m/z值是使用10 mDa质量误差确定的，作者排除了与在特定MSI电离模式中检测概率低的LC-MS/MS数据匹配。具体来说，作者排除了在正电离模式MSI中与LC-MS/MS数据中检测到的磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸物种匹配的特征。此外，作者手动移除了代表噪声或背景离子图像的m/z值，以改善下游图像分割和统计分析。在这些过滤步骤之后，正电离模式检测到的119个峰和负电离模式检测到的83个峰被注释到每个LC-MS/MS数据集。超过75%的注释脂质是m/z在700到900之间的甘油磷脂，而鞘脂和其他主要脂质类别在两种电离模式中占总共202个注释脂质的不到25%（图1b）。
作者接下来对每个组织切片中所有注释化合物的信号强度进行了标准化，以减轻技术变异的来源。在原始强度值中观察到明显的样本内信号漂移，在正模式和负模式中都存在，这也反映在标准化前的原始总离子计数离子图像中（图2a，图2d）。同样，原始样本间信号强度范围在多个样本中变化超过50%，无论电离模式如何（图2a）。值得注意的是，常规总离子电流（TIC）标准化部分校正了正模式和负模式下的样本内信号强度，但未能成功减少样本之间的变异（图2b）。
因此，作者在所有样本中应用了LOESS，以最小化技术偏差，否则这种偏差将限制后续在生物重复样本和处理组之间的统计比较。LOESS标准化仅限于每个非零强度像素，以校正信号漂移，同时保留每个注释化合物的空间分布。此外，作者使用了可变LOESS跨度，将每个样本总像素数的约10%纳入LOESS算法中，以防止过度平滑。与原始数据和TIC标准化数据相比，稀疏LOESS标准化成功校正了样本内信号漂移，并大大减少了正电离模式和负电离模式样本之间的信号变异性（图2c）。稀疏LOESS标准化在减少样本内信号漂移方面的效果在比较稀疏LOESS标准化离子图像与显示像素TIC强度的原始或TIC标准化离子图像时尤为突出（图2d-f）。
通过稀疏LOESS标准化可视化离子图像使作者能够确定脂质空间分布和定位的差异，同时最小化影响样本间比较的技术伪影。作者观察到许多磷脂局限于特定的切片区域，这在正电离模式和负电离模式的所有样本中都是一致的。例如，在负电离模式下注释为磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE) 18:0/22:6、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI) 36:4和磷脂酸(phosphatidic acid，PA) 16:0/16:0的MSI特征高度定位于肺组织内的特定区域（图3a-c）。作者的数据支持PA 16:0/16:0可能是作为PC 32:0的源内碎片形成的观点。重要的是，这三种脂质表现出不同的定位，其中一种脂质的最大丰度与另一种不重叠，并显示出似乎独立于处理或性别引起的潜在影响的分布。
作者还观察到正电离模式下脂质物种定位的差异。然而，不一致的组织切片形态导致脂质空间分布的模式仅通过手动检查离子图像难以区分。具体来说，并非所有在正模式下分析的切片都包含显著的形态特征，如通过可视化注释脂质的个别离子图像可识别的近端气道。因此，作者无法通过个别脂质物种分布在两种电离模式的所有样本中统一定义感兴趣区域。
为解决切片形态不一致导致难以稳健选择感兴趣区域并在处理组间进行后续统计分析的问题，作者基于每个样本中所有注释脂质执行了无监督机器学习图像分割。作者改编了Seurat使用的KNN算法和基于图的聚类方法，以对两种电离模式下的每个肺组织切片进行分割。无监督图像分割导致每个组织切片中多个区域的明显聚类（图4a）。可视化识别的聚类使作者能够准确地将分组像素分配给H&E验证的形态感兴趣区域，同时隔离可能由数据获取中的技术伪影产生的聚类（图4b-d）。在两种电离模式下分析的所有切片中，无监督分割区分了气道和肺泡上皮。然而，作者的无监督方法无法完全排除一些与形态感兴趣区域不重叠的像素（图4b-d）。尽管如此，这些像素相对于每个聚类中包含的总像素的比例并未阻止作者从分割结果中选择感兴趣区域。
接下来，作者评估了每个分割聚类中个别脂质物种的共定位，同时将分析重点放在与形态感兴趣区域重叠的聚类上。作者观察到脂质饱和度、类别和区域之间的有趣关系。定位在气道上皮的多不饱和磷脂酰胆碱（polyunsaturated phosphatidylcholines ，PC）和鞘磷脂（sphingomyelins ，SM）44:1和44:2始终位于丰度前5位的脂质之中。在正电离模式下，含有四个或更少双键的PC以及溶血PC和溶血PE定义了肺泡上皮（图4b、d、e）。相反，在负模式样本中每个区域检测到的前5位脂质并未显示从近端到远端肺区域饱和度降低的模式。每个区域反而是通过特定脂质类别的共定位来区分的。多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸（FA 22:6）和多不饱和PE主要在气道上皮中检测到，而饱和和不饱和磷脂酰甘油（PG）则在肺泡上皮中占优势。
最后，基于MSI数据的特定肺切片的无监督分割使作者能够详细近似估计未纳入下游统计分析的个别肺区域中的脂质丰度。作者从处理组间的比较中排除了特定区域，因为像气道基底膜和远端气道上皮等区域在所有肺切片中都没有被清晰识别。尽管如此，作者的分割方法以高空间分辨率辨别了相邻的肺区域，这得到了组织学数据的支持（图5a、b）。具体来说，作者的分割方法在特定样本中将气道上皮与基底膜分离（图5a、b）。通过可视化与这些区域各自对应的两种多不饱和PC的丰度分布，证实了这一发现，这与作者的H&E数据和分割结果重叠（图5c、d）。这些结果展示了作者的分析能够仅基于注释脂质的定位将肺分割成不同区域，并以高空间分辨率测量区域脂质丰度的能力。
最后，作者使用每个样本的分割图像来比较联合屋尘螨+臭氧暴露在雄性和雌性小鼠肺区域之间的影响。在统计分析之前，作者对每个像素中的各脂质平均丰度进行了对数转换，以获得近似正态的分布。作者最初进行了富集分析，以评估属于结构相似类别的脂质丰度之间的差异。作者观察到，与对照组相比，雌性屋尘螨+臭氧组在气道和肺泡上皮中的多种不饱和脂质类别显著减少，包括不饱和PE和PS（图6a、c）。然而，不饱和FA、PG和PI以及饱和PG、PE和LPE在肺泡上皮中减少，但在气道上皮中没有减少（图6c）。这些多变量变化之后进行的单变量统计分析，识别了被屋尘螨+臭氧减少的个别脂质物种（图6b、d）。有趣的是，作者观察到单个SM物种显著减少和神经酰胺34:1增加，这种现象仅在气道上皮中发生，在基于类别的富集分析中并未反映出来（图6a、b）。总体而言，雌性小鼠肺泡上皮中有32种个别脂质物种因屋尘螨+臭氧而显著改变，而气道上皮中仅有13种个别脂质物种发生改变（图6b、d）。值得注意的是，作者在气道或肺泡上皮中未观察到雄性屋尘螨+臭氧暴露组与对照组之间脂质类别和个别物种丰度的统计学显著差异。然而，作者的统计分析仅限于每个性别和处理组3个样本，仅比较由LC-MS/MS验证的脂质，这代表了跨越两种电离模式约1800个分箱峰的10%。尽管有分析的限制，这些结果为MSI数据中生物重复样本之间的多方面统计比较提供了概念验证，包括多种性别、处理组和形态学上不同的感兴趣区域。
Stevens, N. C., Shen, T., Martinez, J., Evans, V. J., Domanico, M. C., Neumann, E. K., ... & Fiehn, O. (2025). Resolving multi-image spatial lipidomic responses to inhaled toxicants by machine learning. Nature Communications, 16(1), 2954.
