肝癌丨苏兵兵/柏斗胜：GIT1高表达与M2型巨噬细胞浸润及肝细胞癌预后的相关性

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苏兵兵, 张弛, 韦宝森, 曹俊, 彭睿, 屠道远, 蒋国庆, 金圣杰, 柏斗胜. GIT1 高表达与 M2 型巨噬细胞浸润及肝细胞癌预后的相关性[J]. 中华肝脏病杂志, 2025, 33(3): 237-247. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20240827-00396.

通信作者

柏斗胜，扬州大学附属苏北人民医院肝胆外科；江苏省苏北人民医院肝胆外科

摘要

目的

探讨G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白（1 GIT1）在肝细胞癌（HCC）患者中的表达、预后及其相关M2型巨噬细胞浸润在肿瘤微环境的作用。

方法

回顾性收集来自扬州大学附属苏北人民医院于 2015 年 1 月至 2021 年 12 月进行的 HCC 完全手术切除的 140 例患者的临床资料以及其肿瘤组织和癌旁组织样本，进行免疫组织化学分析，根据 GIT1 表达量分为高表达组（48 例）和低表达组（92 例）。通过 Cox 回归分析 HCC 患者预后的危险因素。随机匹配 15 对癌组织及癌旁组织样本进行定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹（WB）、免疫组织化学分析。构建人肝癌细胞株HepG2、HuH7 和 MHCC97-H 以及小鼠肝癌细胞株 Hepa 1-6 的 GITI敲除或过表达细胞株，通过流式细胞术分析对 M2 型巨噬细胞极化影响。构建小鼠成瘤模型，绘制过表达 GIT1 肿瘤组织的生长曲线。通过 OncoLnc、Kaplan-Meier Plotter、UALCAN 和 GEPIA 数据库对癌症基因组图谱（TCGA）数据进行生物信息学分析，探究 GIT1 在 HCC 患者中的差异表达及其对预后的影响。

结果

生物信息学结果表明，GIT1 在 HCC 组织中的表达水平显著高于正常肝组织（P <0.05）。RT-PCR 及 WB 实验结果同样提示 GIT1 在 HCC 中高表达。随访结果提示，GIT1 高表达与 HCC 患者的不良预后相关。GIT1 高表达为 HCC 患者预后不良的独立危险因素（HR=2.562，95%CI：0.231～0.704，P<0.05）。功能富集分析结合 TIMER 数据库分析发现 GIT1 表达水平与 HCC 中多种免疫细胞浸润相关，但与巨噬细胞浸润相关最高（r=0.545，P<0.001）。小鼠成瘤实验表明，GIT1 过表达小鼠肿瘤体积明显增加（P<0.05）。此外，流式细胞术检测提示，GIT1 过表达后 M1 型浸润/极化程度较低（野生型比过表达型：5.06%±0.11% 比 4.09%±0.04%；P<0.05）而M2型浸润/极化程度较高（野生型比过表达型：10.20%±0.33% 比 14.7%±0.12%；P<0.05）。

结论

GIT1 可作为预测 HCC 预后的潜在生物标志物，其高表达在 HCC 进展中发挥促癌作用，促使 M2 型巨噬细胞浸润。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内癌症相关病死的主要原因之一^[1]。尽管近年来 HCC 在诊断和治疗方面取得了显著进展，其整体预后仍然不佳^[2]。HCC 的发生和发展是一个复杂的过程，涉及多种因素和机制，其中肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）在 HCC 的进展中起着关键作用^[3-4]。TME 是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、癌相关成纤维细胞、各种信号分子和细胞外基质等，通过相互作用，共同调控肿瘤的增殖、侵袭和转移过程^[5-6]。

巨噬细胞是维持组织稳态的重要免疫细胞，在多种生理和病理过程中发挥关键作用^[7-9]。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）主要分为 2 种亚型：M1 型和 M2 型。M1 型具有肿瘤杀伤作用，能通过产生高水平的炎性细胞因子和介质促进免疫反应^[10]。相反，M2 型具有免疫抑制表型，能通过分泌抗炎性因子、促进血管生成及基质重塑等机制促进肿瘤的增殖、侵袭和转移^[11]。在 HCC中，M2 型的高浸润与肿瘤的侵袭性增强和不良预后密切相关^[12]。然而，M2 型的浸润调控机制及影响因素仍需进一步深入研究。

G 蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白 1（G-protein-coupled receptor kinase interacting protein 1，GIT1）是细胞内信号调节蛋白，通过与多种信号分子相互作用，参与多种细胞过程，包括细胞迁移、增殖和信号转导^[13-15]。研究结果表明，GIT1 在多种癌症细胞中高表达，并与肿瘤的侵袭和转移相关^[16]。然而，关于 GIT1 与 M2 型巨噬细胞浸润及功能的研究较少，目前研究主要集中于非肿瘤相关的疾病中^[17-21]。在 HCC 中，GIT1 在 TME 对 TAMs 浸润类型及其促肿瘤作用的机制尚未明确。

本研究通过分析江苏省扬州大学附属苏北人民医院的 HCC 患者的术后组织微阵列及随访临床数据，综合多种实验技术，全面探讨 GIT1 在肝癌组织中的表达情况及其机制。本研究重点探讨了 GIT1 在调控 M2 型巨噬细胞浸润中的作用及其对肝癌进展的潜在机制。此外，本研究基于临床样本及实验动物模型，旨在探索 GIT1 作为 HCC 潜在治疗靶点的应用价值，并为进一步理解其在 HCC 中的作用机制提供依据。

资料与方法

1. 病例资料收集：本研究使用的病例资料收集来自江苏省扬州大学附属苏北人民医院于 2015 年1 月至 2021 年 12 月进行的 HCC 完全手术切除的140 例肿瘤组织和癌旁组织样本，用于组织微阵列的制备（委托上海芯超生物有限公司）。本研究通过了江苏省苏北人民医院医学伦理委员会的批准（批准号：2019KY-246），与患者签署了研究知情同意书。回顾性收集了 140 例患者人口学及临床病理学资料，包括：性别、年龄、乙型肝炎病毒 DNA、丙型肝炎抗体、总胆红素、甲胎蛋白、肿瘤分期以及脉管血栓等。

2. 动物实验：雌性 C57BL/6 小鼠（6 周龄，体质量 20～30 g）购自扬州大学比较医学中心[许可证号：SYXK（苏）2022-0044]，严格按照无特定病原体动物环境饲养，遵循 3R 原则。动物实验通过了医院伦理委员会的批准（批准号：202303856）。

3. 实验所用设备、试剂与耗材：本研究所用的试剂与耗材名称、货号及生产商见表1。实验设备均使用江苏省苏北人民医院医学实验中心统一设备，实验操作参照文献^[22]。

4. 生物信息学分析：收集 OncoLnc（www.oncolnc.org）、Kaplan-Meier Plotter（kujuhskmplot.com/analysis）、UALCAN（ualcan. path. uab.edu/）和 GEPIA（gepia2. cancer-pku. cn/）数据库对癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据进行分析，探究 GIT1 在 HCC 患者中的差异表达及其对预后的影响。此外，通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析探究差异基因涉及的潜在生物学功能。

5. 总 RNA 和蛋白的提取：从本院生物样本库申请，随机出库的 15 例患者的癌组织和癌旁组织。按照试剂盒说明提取了癌组织和癌旁组织、人肝癌细胞系的总 RNA，并进行反转录。使用细胞裂解液提取癌组织和邻近正常组织总蛋白、人肝癌细胞系的总蛋白，并进行蛋白定量。癌旁组织定义为距离肿瘤边缘 2 cm 的正常组织。

6. 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR，RT-PCR）：RT-PCR 所用引物序列见表 2。以人 GAPDH作为内参照基因，以人 GIT1作为检测基因，PCR 扩增后获得 Ct值，以检测基因 Ct值-内参照基因 Ct值分析表达量，取 3 次平均值。

7. 蛋白免疫印迹（western blotting，WB）：为了检测 GIT1 在 HCC 组织和癌旁组织以及在细胞系中的蛋白表达量，将组织或细胞裂解、BCA 蛋白定量，定量后使用蛋白上样缓冲液稀释。然后，按照电泳凝胶试剂盒配置凝胶，梯度恒压电泳，转膜，封闭后孵育第一抗体过夜，清洗后，室温水平孵育第二抗体，清洗后在伯乐显影仪显影，Image Lab 软件分析处理图像。

8. 免疫组织化学：取上述构建的石蜡组织芯片，甲醛固定处理，采用柠檬酸钠缓冲液微波热修复抗原，第一抗体孵育后，使用二氨基联苯胺法（diaminobenzidine，DAB）染色处理 50 s 后放入磷酸盐缓冲液中终止，再用苏木精染色 40 s 放入磷酸盐缓冲液中终止，中性树胶封片。具体操作参照文献^[14，21]。免疫组织化学评分：由 2 位副主任病理科医师独立对染色切片扫描后进行评分和诊断，采用组织化学分数法进行评分。GIT1 表达数据分析中，0～3 分为低表达，4～12 分为高表达^[23]。采用ImageJ pro plus 6.0 软件自动分析，按照阳性贡献率进行自动评分，以定量评估分化簇（cluster of differentiation，CD）68 的表达水平。

9. 构建 GITI 敲除或过表达细胞株：人肝癌细胞株 HepG2、HuH7 和 MHCC97-H 以及小鼠肝癌细胞株 Hepa 1-6 置于含有 10% 胎牛血清和 1% 双抗（青霉素和链霉素抗性）的 DMEM 培养基中培养。THP-1 单核细胞在含有 10% 胎牛血清、1% 双抗和1%β-巯基乙醇的 RPMI 1640 培养基中培养。实验操作参照文献^[24-25]进行稳转细胞系的构建，并于转染 3 d 后开始予以 3 μg/mL 嘌呤霉素进行筛选。

10. 免疫浸润相关性分析：TIMER 2.0（timer.cistrome.org/）是一个专注于肿瘤免疫系统的在线工具和数据库，广泛应用于免疫细胞分析与肿瘤研究。本研究利用 TIMER 2.0 数据库，分析 GIT1 表达水平与 B 细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞（dendritic cells，DCs）浸润程度之间的相关性。

11. 流式细胞术检测：将体外共培养后的巨噬细胞收集至流式细胞管中进行细胞计数，随后加入相应抗体，在避光条件下孵育 60 min 后清洗，4 ℃下400×g离心 5 min，弃去上清液；加入 500 μL 磷酸盐缓冲液重悬后进行流式细胞仪检测。实验分组：阴性对照组、阳性对照组（CD68、CD86、CD163）以及实验组。肿瘤组织中的淋巴细胞分离后，分组：阴性对照组、阳性对照组（CD11c、CD86、CD163）以及实验组（过表达 GIT1组）。实验具体操作方法参照文献^[24]。

12. 诱导 THP-1 细胞分化及与肿瘤细胞共培养：使用 100 ng/mL 佛波酯将 THP-1 细胞诱导极化后，与过表达以及野生型 Huh7 细胞共培养，96 h 后，收集巨噬细胞，应用流式细胞术检测巨噬细胞的极化比例。

13. 构建小鼠成瘤模型：分为对照组与过表达GIT1 组，每组 6 只小鼠，根据实验要求注射对数期生长的 Hepa1-6 细胞（2.5×106个）在小鼠左侧肩背部，每隔 3 d 观察并记录 1 次，在第 18 天取肿瘤组织，测量组织质量（g）和体积（mm3）、拍照并绘制肿瘤生长曲线。

14. 统计学方法：使用 SPSS 26.0 和 Graphpad Prism 10.0 软件进行数据处理。定量资料组间比较采用 t检验；计数资料组间比较采用 χ2 检验。生存时间和复发率运用 Kaplan-Meier 曲线分析。Cox 回归用于分析独立危险因素。计算 Spearman的相关系数的评估相关性。对于三组间比较，使用单因素方差分析。P<0.05 为差异具有统计学意义。

结果

1. GIT1 在肝癌组织中高表达且与预后不良相关：通过 GEPIA 数据库分析 TCGA 中多种肿瘤样本，结果显示，GIT1 在 HCC 的表达水平显著高于相应的正常肝组织（图 1A）。此外，对收集的 15 对匹配的癌组织及癌旁组织进行 RT-PCR 及 WB 分析，结果表明，GIT1 在癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P<0.05）（图 1B～C）。免疫组织化学染色对140 例患者的癌组织及癌旁组织的微阵列分析也得到了印证（图 1D～E）。将患者以 GIT1 表达量高低进行分组，分析比较基线信息与临床病理特征（表 3）。随着 HCC 的临床分期和病理分级增加，GIT1 的表达水平也相应升高（P<0.05）（图 1F～G）。为了进一步探究 GIT1 表达与 HCC 患者预后的关系，利用本研究随访的预后数据 Kaplan-Meier 分析，GIT1 高表达患者组预后明显差于低表达组，而复发率明显高于低表达，差异具有统计学意义（P<0.05）（图 1H～I）。

2.GIT1 高表达是 HCC 患者预后不良的危险因素：单因素 Cox 回归分析结果表明，GIT1 表达水平对 HCC、黑色素瘤、子宫内膜癌患者的总生存率（overall survival，OS）的独立危险因素（图 2A）。特别是在 HCC 患者中，GIT1 的高表达与不良临床预后相关：GIT1 高表达的 HCC 患者的 OS、无进展生存期（progression-free survival，PFS）、无复发生存期（relapse-free survival，RFS）以及疾病特异性生存期（disease specific survival，DSS）均低于低表达 HCC 患者，差异具有统计学意义（P<0.05）（图 2B～E）。

3.GIT1 高表达是 HCC 患者预后不良的独立危险因素：为了进一步探究 GIT1 高表达对 HCC 患者预后的影响，通过本中心数据单因素 Cox 回归分析，发现血管癌栓、肿瘤包膜、肿瘤大小、肿瘤分化程度、巴塞罗那分期及 GIT1 表达是 HCC 患者预后的影响因素（P<0.05）（图 3A）。将单因素分析结果显示差异具有统计学意义的变量纳入多因素回归分析，结果提示，血管癌栓[危险比（hazard ratio，HR）=2.537，95% 置信区间（confidence interval，CI）：1.636～4.369，P=0.003]、Ⅰ～Ⅱ期肿瘤分化（HR=2.723，95%CI：1.326～6.511，P=0.014）、肿瘤直径 >5 cm（HR：1.795，95%CI：1.001～4.201，P=0.043）、巴塞罗那 B+C 期（HR=2.562，95%CI：1.672～4.129，P=0.002）及 GIT1 高表达（HR=0.354，95%CI：0.231～0.704，P=0.008）是影响 HCC 患者预后独立因素（图 3B）。

4.GIT1 表达与多种免疫细胞免疫浸润相关：将GIT1 高、低表达患者分组并通过 KEGG 功能富集试验发现，GIT1 与细胞因子-细胞因子受体相互作用、钙信号通路、环磷酸腺苷信号通路等免疫相关通路相关（图 4A）。为了进一步探究 GIT1 表达与免疫浸润的相关性，通过 TIMER 2.0 数据库分析其表达与HCC TME 中免疫浸润相关性，结果提示 GIT1 表达水平与多种免疫细胞的浸润呈正相关，包括 B 细胞[ 相关系数（r）=0.358，P<0.05]、CD8+T细胞（r=0.339，P<0.05）、CD4+T细胞（r=0.482，P<0.05）、巨噬细胞（r=0.545，P<0.05）、中性粒细胞（r=0.478，P<0.05）、树突状细胞（r=0.469，P<0.05）（图 4B）。其中，巨噬细胞浸润相关性最高。

5.GIT1 表达与巨噬细胞浸润呈正相关：深入探究了 GIT1 表达与巨噬细胞浸润的关系，对本研究收集的 15 例 HCC 组织样本进行了免疫组织化学分析。结果表明，发现 GIT1 表达水平较高的组织，CD68 的水平也显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）（图 5）。

6. 体外实验结果表明肝癌 GIT1 过表达细胞促进TAMs 向 M2 型巨噬细胞极化：WB 验证了 HepG2、HuH7 和 MHCC97-H 的 GITI 相对表达量，在MHCC97-H 细胞中表达量最高，Huh7 细胞表达最低（图 6A）。因此，构建敲低 shGIT1 的 MHCC97-H细胞系和过表达 OE-GIT1 的 Huh7 细胞系（图 6B）。为了进一步验证 GIT1 在 HCC 细胞中对巨噬细胞的影响，本研究通过将 THP-1 细胞诱导的 M0 型细胞与 OE-GIT1 的 Huh7 细胞共培养 96 h 后，使用流式细胞术检测巨噬细胞极化比例。结果表明，野生型Huh7 细胞对比 OE-GIT1 的 Huh7 细胞，极化为 M1 的平均比例分别是 5.06%±0.11% 比 4.09%± 0.04%，差异具有统计学意义（P<0.05），M2 的平均比例分别是 10.20%±0.33% 比 14.70%±0.12%，差异具有统计学意义（P<0.05）。因此，GIT1 高表达可能通过促进巨噬细胞向 M2 型极化。

7．小鼠成瘤实验结果表明 GIT1 过表达促进肿瘤生长且促 M2 型巨噬细胞浸润：小鼠实验结果表明，过表达组肿瘤体积大于野生型组（图 7A～C），过表达组中肿瘤体积明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。在肿瘤组织中的淋巴细胞，过表达 GIT1 组 M1 型细胞的比例低于野生型组（12.4%比 9.53%，P<0.05），而 M2 型巨噬细胞比例高于野生型组（6.19% 比 7.91%，P<0.05）（图 7D～G）。以上结果表明，GIT1 过表达患者可能通过增加 M2 型巨噬细胞进而促进 HCC 进展。

讨论

HCC 在全球范围内具有较高的发病率和病死率^[15，26]，目前，主要的治疗手段是外科手术、靶向治疗和免疫治疗等，然而，术后复发以及对靶向和免疫治疗的不敏感性仍是亟待解决的问题。因此，寻找更有效的治疗或增敏当前综合治疗的方法至关重要。研究结果表明，GIT1 在多种实体瘤中高表达，促进癌细胞的迁移和侵袭^{[16-18，27-29]}，并与不良预后相关。本研究结果显示，GIT1 在 HCC 中的高表达与中晚期临床分期和较高的病理分级相关，且 GIT1 高表达患者的 OS、PFS、RFS 以及 DSS 更短。这些结果表明，GIT1 有作为 HCC 预后生物标志物的潜力，并可能有助于早期诊断和治疗决策。尽管 GIT1 在多种癌症中的作用已有报道，但其与肿瘤微环境重塑的关系研究仍然有限。特别是，GIT1 与巨噬细胞M2 型浸润之间的机制研究，在大多数恶性肿瘤中尚未得到深入探讨。了解 GIT1 与 M2 型巨噬细胞浸润的关系，不仅可以揭示 HCC 发展的新机制，还可为开发创新治疗策略提供重要线索。

TME 在 HCC 的发生发展中起着关键作用，其中多种免疫细胞共同参与肿瘤的进展^{[20-23，30-33]}。巨噬细胞因其高度的可塑性，在 TME 中发挥至关重要的作用，经典激活的巨噬细胞在肿瘤微环境内可极化为 M1 和 M2 两种不同表型，M1 巨噬细胞具有促炎作用和抗肿瘤效应；而 M2 巨噬细胞则通过分泌抗炎细胞因子、促进血管生成及免疫逃逸，从而促进肿瘤增殖、转移及进展^[24，34]。通过富集分析发现，肝癌细胞中高表达 GIT1 与多种免疫相关信号通路有关。既往研究结果表明^[35]，在 TME 中，受体结合可发挥双向调控作用，即既可诱导免疫抑制环境，也可激活抗肿瘤免疫。免疫浸润分析进一步显示，GIT1 的高表达与免疫细胞浸润尤其是巨噬细胞浸润呈正相关。为了确浸润巨噬细胞的亚型，本研究将人源肿瘤细胞与人源巨噬细胞共培养，经流式细胞术检测发现，GIT1 高表达肿瘤细胞促进巨噬细胞的 M2 型极化。小鼠体内实验发现，过表达 GIT1 的肿瘤组中，肿瘤体积和质量显著增加，且 M2 型巨噬细胞浸润明显增多。

本研究结果表明，GIT1 过表达与增加 HCC 微环境中 M2 型巨噬细胞浸润，提示 GIT1 表达增加可能是 HCC 免疫抑制微环境重要因素。尽管本研究提供了 GIT1 在 HCC 中表达及其与免疫浸润相关性的有力证据，但仍存在一些局限性。首先，本研究的样本量相对较小，未来需要在更大的患者群体中进行验证。其次，本研究主要关注了 GIT1 与巨噬细胞的相关性，但 GIT1 与其他种类的免疫细胞相互作用需要进一步的研究来阐明。此外，GIT1 在 HCC 中的具体分子机制尚不完全清楚，未来的研究需要深入探索 GIT1 如何调控免疫细胞浸润和肿瘤进展。

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（来源：中华肝脏病杂志）

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