4+衰老+分型+机器学习+实验，由热点开展分型的经典思路，快来学习！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Role of Aging in Ulcerative Colitis Pathogenesis: A Focus on ETS1 as a Promising Biomarker”，这篇文章发表在J Inflamm Res期刊上，影响因子为4.2。

结果：

UC与正常样品中DEG的鉴定

去除批次效应后，两个数据集中的样本均匀分散，表明获得了可靠的结果（图1A）。在三个数据库中总共鉴定了1025个共有的UC相关基因（图1B）。此外，Limma用于表征UC与正常样品中的DEG，并筛选了2786个DEG，其中1624个上调基因和1162个下调基因（图1C）。排名前30位的DEG（按|log 2 FC|）显示在热图中（图1D）。随后，为了探索衰老在UC病理学中的意义，作者进行了Venn分析以整合DEG、UC和ARG，并最终确定了95个DE ARG用于进一步分析（图1 E）。此外，GSVA显示UC样品中JAK/STAT信号传导途径的异常活化（P< 0.0001，图1F）。JAK/STAT信号通路在免疫和炎症反应的调节中起着至关重要的作用。34最新的研究已经确定了UC患者上皮中独特的炎症相关细胞状态，主要归因于JAK/STAT途径激活。这与作者的发现是一致的。

UC和正常样本中免疫细胞浸润的分析

考虑到UC的特征在于免疫紊乱，作者采用CIBERSORT算法分析来自训练集的样本中的22种细胞类型。如图2A所示，浆细胞、M2巨噬细胞和静息肥大细胞在正常和UC样本中占浸润比例较高。值得注意的是，UC和正常样品具有明显不同的免疫谱。在两组中观察到14种不同的免疫细胞类型（图2B）。例如，与正常对照相比，UC样本中记忆B细胞、M1巨噬细胞和活化树突状细胞的丰度水平明显增加，而M2巨噬细胞和静息肥大细胞的水平降低。这些细胞浸润的水平已被证实在UC患者和正常个体之间显著不同。

UC两种衰老相关亚型的筛选

为了全面了解UC中ARG的表达模式，作者使用了基于95个DE-ARG表达的一致性聚类算法。CDF曲线显示，当k = 2时，曲线具有较低的斜率，表明聚类结果是可靠的（图3A）。因此，整个队列被分为两个衰老相关亚型（图3B）。PCA进一步证实，可以清楚地区分两种亚型（图3C）。接下来，为了研究ARG在免疫微环境中的作用，使用CIBERSORT算法分析了两种亚型中免疫细胞的浸润水平。正如预期的那样，两种亚型显示出不同的免疫浸润模式。作者还观察到浆细胞和M2巨噬细胞在两种亚型中占主导地位（图3D）。11种免疫细胞在亚型1和2之间表现出显著不同的丰度水平（图3E）。其中，亚型1的浆细胞、CD 8 T细胞、M2巨噬细胞和静息肥大细胞水平升高，而亚型2的记忆B细胞、活化树突状细胞和中性粒细胞水平升高。此外，GSVA揭示了亚型2中JAK/STAT信号传导途径的显著富集（图3F）。此外，差异表达分析确定了亚型1和2中的1443个DEG（606个上调和837个下调）。火山图显示所有DEG的分布，热图显示前30个DEG（图3G和H）。

通过WGCNA识别关键模块

作者使用WGCNA来识别与这些亚型相关的核心模块。当软阈值为6时，生物网络达到无标度，连通性趋于平滑;因此，它是最佳阈值（图4A）。图4 B中示出了所有样品的聚类树图。检测到与亚型相关的十三个亚型，其中蓝色和洋红模块与分子亚型具有最强的关联（图4C）。蓝色表示与亚型1负相关（r =-0.7，P= 3e-25），而洋红色表示与亚型1正相关（r = 0.6，P= 7 e-17）。之后，维恩图揭示了WGCNA、亚型中的DEG和用于后续探索的DE-ARG中的54个重叠基因（图4D）。

UC诊断性生物标志物的筛选

利用两种机器学习算法，对UC的特征基因进行了识别。LASSO分析确定了9个关键变量，基因收缩趋于稳定（图5A和B）。随机森林模型筛选了21个基因，对应于最高的准确率（图5C）。图5D显示了基于MeanDecreaseGini的随机森林模型中重要基因贡献的排名。通过整合这两种算法鉴定了七种共有的生物标志物（CD34、CXCL1、ETS1、IL1RN、IL7R、TIMP1和VCAM 1）（图5E）。随着复杂生物模型的发展，单一生物标志物用于临床诊断的有效性逐渐受到限制。因此，作者建立了基于这七个生物标志物的多变量logistic回归模型。结合两个变量（ETS1和IL7R）的模型表现出令人满意的准确性，上级其他组合。在训练组、GSE 169568验证组和GSE 94648验证组中，AUC值分别为0.96、0.817和0.882（图5F和G）。AUC在0.8和1.0之间被认为是测试的总体诊断准确性的极好。因此，该模型对于UC诊断是可靠和准确的。

两个诊断基因与生物学特性的相关性分析

作者进一步观察了模型中的基因与差异免疫细胞或JAK/STAT信号通路活性之间的联系。结果显示，ETS 1和IL 7 R与活化的树突状细胞、嗜中性粒细胞、活化的记忆CD 4 T细胞、记忆B细胞和M0巨噬细胞正相关（红线表示正相关），但与静息肥大细胞、M2巨噬细胞和CD 8 T细胞负相关（蓝线表示负相关;图6A）。此外，两种诊断基因的表达增加显著促进JAK/STAT信号传导途径的活性（对于ETS 1，R = 0.75;对于IL 7 R，R = 0.76;P<0.05;图6 B和C）。总之，这两种生物标志物可能通过调节免疫细胞浸润和调节JAK/STAT信号通路，从而影响结肠中的炎症反应，在UC发病机制中发挥作用。

实验性结肠炎中Hub基因表达水平的确认

为了证实生物信息学分析的结果，作者在小鼠中建立了DSS诱导的UC模型。与对照组相比，模型组中小鼠的体重随着治疗时间的增加而显著降低（图7A）。在此期间，模型组中小鼠的DAI评分持续升高（图7B）。作者还观察到，施用DSS溶液的小鼠在第4天开始表现出诸如抑郁、深色皮毛和持续腹泻的特征。此外，在第7天，在模型小鼠的肛门周围观察到出血和软便（图7C）。进一步评价显示，模型组小鼠结肠长度明显缩短，肠粘膜出现糜烂、充血和水肿（图7D和E）。同时，模型组小鼠的CMDI评分显著高于对照组小鼠（图7E）。这些变化直观地表明了小鼠中UC的发展，证明UC模型成功构建。38通过qRT-PCR测定这两种基因的表达水平。结果显示，模型组大鼠脑组织中ETS 1 mRNA水平明显高于对照组。尽管IL-7 R表达在模型组中倾向于下降，但其与UC发生不显著相关（图7 F）。

总结

UC样本分为两个亚型（1和2），其在免疫景观和JAK/STAT信号通路中显示出显著差异。采用一系列机器学习算法筛选出ETS 1和IL 7 R两个特征基因建立诊断模型，取得了较好的诊断效果。此外，这些枢纽基因与特异性免疫细胞（如中性粒细胞、记忆B细胞和M2巨噬细胞）的浸润以及JAK/STAT途径密切相关。后来，实验验证证实，在UC小鼠模型中，ETS 1表达显著增加。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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