4+m6A甲基化+机器学习+分型+实验，简简单单，换个疾病又能轻松发文！！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Role of m6A Methylation Regulators in the Diagnosis and Subtype Classification of COPD Based on the GEO Database”，这篇文章发表在J Cell Mol Med期刊上，影响因子为4.3。

结果：

慢性阻塞性肺疾病患者m6A甲基化调节因子的分布

共鉴定了23个m6 A甲基化调节子，包括7个“编写者”（胃L3、胃L4、WTAP、ZC 3 H13、RBM 15、RNM 15 B和CBLL 1）、14个“阅读者”（YTHDC 1、YTHDC 2、YTHDF 1、YTHDF 2、YTHDF 3、HNNRPC、LPPPRC、HNRNPA 2B 1、IGFBP 1、IGFBP 2、IGFBP 3、RBMX、ELAVL 1和IGF 2BP 1）和2个“擦除者”（FTO和ALKBH 5）。发现15种m6 A甲基化调节剂差异表达（5种编写者：胃L3、WTAP、RBM 15、RBM 15 B和CBLL 1; 8种读取者：YTHDC 1、YTHDC 2、YTHDF 1、YTHDF 2、HNRNPC、LRPPRC、HNRNPA 2B 1和RBMX; 2种擦除者：FTO和ALKBH 5，p< 0.05）。表达模式以热图、直方图和箱形图直观地表示，揭示了许多甲基化调节剂，包括胃L3、RBM 15、RNM 15 B、CBLL 1、YTHDC 2、YTHDF 1、YTHDF 2、HNNRPC、LPPPRC、RBMX、FTO和ALKBH 5，在COPD患者中显著过表达，而WTAP、YTHDC 1和HNRNPA 2B 1在这些患者中显示降低的表达水平（图1A-C）。

慢性阻塞性肺疾病患者m6A甲基化调节因子的相关性研究

“作者”、“读者-作者”和“擦除者”之间存在显著相关。CBLL 1、ELAV 1、HNRNP 2B 1、LRPPRC、胃L3、胃L4、RNM 15 B、YTHDC 2和YTHDF与ALKB 5呈正相关。相反，WTAP与ALKB 5呈显著负相关。此外，IGFBP 1、IGFBP 3、胃L3、胃L4、RBM 15 B、RNMX和YTHDF 1与FTO正相关，而WTAP、YTHDF 3和ZC 3 H13与FTO负相关（图2）。

RF模型和SVM模型结果

利用DEM分别通过RF和SVM模型预测COPD的发病率。“残差的反向累积分布”（图3A）和“残差的箱形图”（图3B）表明，RF模型显示出比SVM模型更小的残差，表明预测COPD发病率的稳定性更高。基于RF模型中不同样本组的误差值选择最佳树计数（图3C）。选择重要性得分大于1的基因，并将其重要性可视化（图3D）。ROC曲线进一步验证了RF模型的上级稳定性，如与SVM模型相比其更大的曲线下面积所证明的（图3E）。

诺模图模型

用11个DEM构建的列线图模型证明在预测COPD的发病率方面是稳定的（图4A）。校准曲线证实了模型在反映预测值与实际概率之间的准确性，并对偏倚进行了调整（图4B）。DCA证明该模型为COPD患者提供了净获益，表明有利的成本效益比和阈值概率（图4C）。临床预测模型强调列线图在预测COPD发生中的功效（图4D）。

m6A甲基化亚型

基于15个DEM将COPD患者分类为不同的m6 A甲基化亚型，产生两个主要亚型：由59名COPD患者组成的亚型A和由52名患者组成的亚型B（图5A-D）。热图和框图描述了这些亚型之间DEM的差异表达。亚型A显著表达胃L3、RBM 15、RBM 15 B、CBLL 1、YTHDC 2、YTHDF 1、YTHDF 2、HNRNPC、LRPPRC、RBMX、FTO和ALKBH 5，而亚型B的特征在于WTAP、YTHDC 1和HNRNPA 2 B1的较高表达水平（图5 E、F）。使用15个DEM，PCA最终将COPD患者区分为这两种亚型（图5G）。

免疫细胞浸润结果

通过ssGSEA测定COPD患者中免疫细胞的丰度。评估m6A甲基化调节剂与免疫细胞之间的相关性。对两种m6A亚型和相关免疫细胞浸润的箱形图的分析显示，嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞在亚型B中高度富集，而单核细胞和活化的B细胞在亚型A中占优势（图6A）。这一发现表明，不同类型的细胞免疫参与调节COPD中的m6A甲基化。对详述m6A甲基化调节剂和免疫细胞之间的相关性的热图的进一步分析（图6B）表明，m6A甲基化调节剂WTAP与许多免疫细胞正相关。具体来说，与低表达组相比，WTAP的过表达与中性粒细胞和嗜酸性粒细胞显着正相关（图6C）。

GO和KEGG富集分析

鉴定了总共1120个基因（DEG）（图7A）。GO分析揭示了生物过程中的显著富集，包括解旋酶活性调节、对白细胞介素-1的应答、组蛋白脱乙酰酶结合和CXCR趋化因子受体结合（图7 B-D）。同时，KEGG通路分析突出了诸如NF-κB信号传导通路、肿瘤坏死因子信号传导通路和IL-17信号传导通路等通路的富集（图7 E、F）。

两种m6 A基因型的鉴定

基因型A和B对应于在COPD患者中观察到的m6 A甲基化亚型（图8A-D）。利用基因型A和B之间的前155个DEG来创建基因表达热图（图8 E）。15种DEM的差异表达水平和m6 A基因型A和B中免疫细胞浸润模式的比较显示与m6 A甲基化亚型的相似性（图8 F、G）。比较不同m6 A甲基化亚型和m6 A基因型的m6 A评分的进一步分析揭示，m6 A甲基化亚型A和m6 A基因型A的评分高于亚型B和基因型B的评分（图8 H，I）。使用Sankey图简洁地可视化了基因型、甲基化亚型和评分之间的关系（图8 J）。

m6A甲基化亚型、m6A基因型和HDAC家族蛋白表达结果

HDAC的表达谱显示了m6A甲基化亚型之间的显著差异。HDAC 2和HDAC 4主要在m6A甲基化亚型B和基因型B中表达，而HDAC 1、HDAC 3和HDAC 6在m6A甲基化亚型A和基因型A中显示更高的表达水平（图9A、B）。

免疫荧光法检测HDAC 2在BEAS-2B细胞中的表达

免疫荧光染色显示，对照组中的BEAS-2b细胞在20倍和40倍放大下保持正常的梭形形态。这些细胞表现出完整的细胞膜和细胞核，在细胞核中具有显著的HDAC 2表达（图10A-C）。相比之下，暴露于5%CSE破坏了正常的细胞结构，导致细胞变圆并导致膜和核降解。同时，HDAC 2表达显著降低，表明CSE暴露可降低HDAC 2水平并破坏细胞形态（图10A-C）。

胃L3、NF-kB和HDAC 2的蛋白质印迹

Western blotting检测BEAS-2B细胞中各种蛋白的表达。与对照组相比，5%CSE模型组胃黏膜L3、NF-κ B和磷酸化NF-κ B的表达明显升高，HDAC 2和核HDAC 2（nHDAC 2）的表达明显降低。这表明CSE可能通过激活胃L3和NF-κB途径触发炎症反应，进而抑制HDAC 2表达（p值：胃L3 < 0.000，NF-κ B <0.000，nNF-κ B <0.000，HDAC 2 < 0.000，磷酸-NF-κ B < 0.000，图11 A-J）。