开挂了！开挂了！温州市人民医院高明勇团队用当下最火的“机器学习+代谢重编程联合分析”这个热点思路，拿下了Theranostics，12+的顶级期刊！这个性价比是不是绝了~实验咱们也不排斥，但是这个生信思路真的很吸引人啊！想不想拥有这开挂的人生？今天馆长就给大家介绍一下这篇高分SCI~
该研究团队以神经母细胞瘤（NB）作为研究对象，以代谢重编程作为切入点，采用机器学习算法对946例临床样本进行了组织和回顾性分析，提出了一种新的临床分层策略，从而进一步指导NB患者的治疗。作者巧妙的融合了多个生信热点，先声夺人，做好了准备。另外该团队在经过系统的生信分析构建相关预后模型后，还从整体微环境和炎症微环境的差异对模型性能进行了评估，并且分别基于外部单细胞公共数据集和LC-MS/MS代谢组学验证上述结果。话不多说，12.4分的高分文章思路大家赶快来学习吧！（ps：想要了解机器学习、生信分析或者这种文章思路复现的，都可以联系馆长，助力科研打怪发文，感兴趣的直接扫码dd馆长~！）
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l题目：通过剖析代谢重编程对肿瘤微环境和进展的影响，开发神经母细胞瘤的靶向治疗
l杂志：Theranostics
l影响因子：IF=12.4
l发表时间：2024年1月
后台回复“666”获取原文献，编号20240922
研究背景
神经母细胞瘤（NB）是起源于早期神经细胞的一种癌症，其特征为突变的成神经细胞无法正常发展。尽管目前采用了化疗、放疗和手术等多模式治疗，但高危NB患者的5年生存率仍低于40%，因此迫切需要明确的生物学或分子标记物来指导治疗。代谢重编程是多种恶性肿瘤发生和发展的基础，而相关研究表明细胞自主遗传改变在代谢重编程中具有重要意义。然而遗传异质性如何影响NB的代谢重编程以及临床预后与药物敏感性之间的关联机制仍有待阐明。因此，该研究采用包括机器学习算法在内的多步骤过程，对946例临床样本进行了组织和回顾性分析，提出了一种新的基于代谢重编程的临床分层策略，从而进一步指导NB更有效、更有针对性的治疗方案的开发。
数据来源
作者回顾性分析了946个样本的RNA测序数据，其中对照组（n=298）来源于GTEx数据库；从TARGET数据库中获取150个NB样本；从GEO数据库中收集498个NB样本。此外作者还纳入了包含283例患者的GEO数据集，在排除缺乏临床参数的患者后，共有276例患者被用作外部测试队列。
研究思路
在这个研究，作者基于相关数据库获得代谢重编程相关基因（MG）异常表达谱，基于单变量Cox分析、LASSO回归和多元Cox筛选关键预后MG（PMG）并构建最终模型。随后作者对上述关键MG（kPMG）进行基因集富集分析和转录因子（TF）与kPMG的相关性分析。接着作者对MPS鉴定的MPS-I和MPS-II NB的整体微环境和炎症微环境的差异进行了评估，并基于体外和体内模型对MPS的分层能力进行了检验。此外作者还选取关键临床因素利用MPS构建了一个IPI模型。最后作者分别基于外部单细胞公共数据集和LC-MS/MS代谢组学验证上述结果。
图1 技术路线
主要结果
1.特征选择和MPS建模
作者先是整合相关数据库获得代谢重编程相关基因（MG）异常表达谱（图2A），其中在NB队列中发现42个 MG上调，110个MG下调。接着作者基于单变量Cox分析、LASSO回归和多元Cox筛选关键预后MG（PMG）并构建最终模型（图2B-D），而该模型表现出有效鉴别NB与正常组织之间的性能（图2E）。
图2 特征选择和MPS建模
2.MPS验证及效应分析
接着作者对所有受试者分配相应的MPS评分，根据最佳截断值0.493（图3A-C）将其分为MPS-I和MPS-II组。结果表明MPS评分与总生存时间呈显著负相关（图3D-F）。此外训练队列（5年为0.807）和测试队列（0.759）的C指数结果均证实了MPS具有良好的一致性（图3G），MPS具有良好的校正性（图3H）。单因素和多因素Cox分析结果表明MPS可以进一步对临床NB亚型进行分层，优于目前常用临床预测方法（图3I-L）。此外与MYCN状态、INSS分期和INRG分层相比，MPS表现出更强的识别能力（图3J-K），净再分类改善（NRI）分别为39.8%、44.4%和18.2%（图3M）。决策曲线还表明，MPS分层的净效益显著高于目前的临床预测方法（图3N）。
图3 MPS验证及效应分析
3.代谢重编程特征分析
随后作者对上述关键MG（kPMG）进行了一项基因集富集分析（GSEA）。结果显示在MPS-I NB组中细胞周期、DNA复制和蛋白质合成等生物进程及戊糖磷酸途径和脂肪酸生物合成等通路显著上调（图4A-E）。作者进一步研究了MPS-I和MPS-II NB组中kPMGs的表达。结果表明ALDH1A2与NB患者的总体生存时间呈负相关（图4G-I）。此外作者发现MPS-I NB对类维甲酸及维甲酸衍生物具有内在耐药（IDR）。这可能导致NB恶化，从而导致MPS-I NB患者的不良预后（图4J）。
对参与肿瘤进展的差异表达转录因子（TF）与kPMG的相关性分析揭示了TF-kPMG调控网络（图4F），证实了43对正向调节关系和15对负向调节关系。
图4 代谢重编程特征分析
4.MPS-I和MPS-II NB整体肿瘤微环境分析
肿瘤微环境长期以来被认为是NB进展的重要决定因素。因此作者对MPS鉴定的MPS-I和MPS-II NB的整体微环境进行了评估。结果表明MPS-I NB组的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分平均值明显低于MPS-II NB样品（图5A-C）。相比之下，MPS-INB的肿瘤纯度明显高于MPS-II NB，并与MPS评分呈正相关（图5D）。而这些发现在测试队列中得到进一步证实（图5E-H），表明MPS-I NB组中免疫微环境被显著抑制。
图5 MPS-I和MPS-II NB整体肿瘤微环境分析
5.MPS-I和MPS-II NB免疫微环境差异分析
随后作者进一步研究MPS-I NB的免疫抑制微环境。结果表明在28种免疫细胞组分中，MPS-I NB组有14种浸润丰度显著降低（图6 A-B）。此外这14种细胞成与MPS评分呈负相关（图6C）。而浸润丰度和关键免疫细胞动态相互作用网络的显著差异可能提示MPS-I NB恶性进展的细胞机制，形成了特异性免疫抑制微环境，高度强化MPS-I NB的不良预后。作者还检测了MPS-I和MPS-II NB样本中关键免疫检查点基因的表达差异，发现淋巴细胞激活基因3（LAG3）在MPS-II NB中高表达，或许针对LAG3的免疫治疗可能有利于MPS-II患者的临床治疗（图6D）。
图6 MPS-I和MPS-II NB免疫微环境差异分析
6.MPS-I和MPS-II NB炎症微环境分析
作者还研究了MPS-I和MPS-II NB中炎症微环境的差异（图7A），其中45种炎症相关生物进程在MPS-I NB组有6种表达水平上调和12种下调（图7B-C）。上述发现表明MPS-I NB患者的恶性进展和预后不良与炎症微环境的显著失调之间存在很强的相关性。此外作者还发现共有13个关键的炎症免疫相关分子如白细胞介素和CD4 T细胞标志物在MPS-I和MPS-II NB之间存在差异表达（图7D）。
图7 MPS-I和MPS-II NB炎症微环境分析
7.药敏结果及作用机制分析
接下来作者对MPS的分层能力进行了检验，结果证实了MPS模型能有效的将NB患者区分开来（图8 A）。而NB药敏结果表明MPS-II NB细胞对依托泊苷具有显著敏感性，而MPS-I NB细胞对AZD7762和XMD13-2具有显著敏感性（图8B）。基于此，作者分别建立了治疗体外模型，与生物信息学分析结果相似，AZD7762的IC50值明显较低（图8C-F）。采用流式细胞术研究潜在的细胞和分子机制。结果显示AZD7762和依托泊苷处理分别显著诱导MPS-I和MPS-II NB细胞凋亡（图9A-D）。TUNEL实验佐证了上述结果，AZD7762处理的MPS-I和依托泊苷处理的MPS-II组中凋亡细胞的比例显著增加（图9E-F）。线粒体膜电位结果表明AZD7762和依托泊苷处理分别显著降低了MPS-I和MPS-II NB细胞的线粒体膜电位（图9G-H）和显著影响关键促凋亡蛋白的表达（图9I-J）。
图8 药敏分析
图9 细胞模型中疗效作用机制分析
8.个体化治疗小鼠模型构建及机制分析
在体外模型取得良好结果的基础上，作者建立体内模型进一步验证MPS风险分层策略在人NB靶向治疗中的临床应用潜力。与体外实验结果相似，分别用AZD7762和依托泊苷处理的MPS-I和MPS-II NB异种移植物的增殖与相应的对照组相比显著降低（图10A-C）。免疫荧光染色再次验证AZD7762和依托泊苷的抗增殖活性（图10D-E）。AZD7762处理的MPS-I NB异种移植物和依托泊苷处理的MPS-II肿瘤中凋亡细胞显著增加（图10F-H）。相应地，免疫组化结果也证实了线粒体通路中关键促凋亡蛋白的表达水平显著提高（图10G-K）。基于目前的MPS分层策略，AZD7762和依托泊苷对敏感NB亚型的治疗效果可靠。
图10 个体化治疗小鼠模型构建及机制分析
9.IPI构建与验证
作者参考最近发表的研究，选取关键临床因素利用MPS构建了一个IPI模型（图11A-C），并基于此和生存函数值将NB患者分为三个风险水平组。生存分析表明IPI能够准确预测NB患者的预后（图11D-E）。低危组的预期生存率最高，中危组的预期生存率居中及高危组的预期生存率最低。TROC曲线证实IPI在5年生存预测方面表现出优越的稳健性和准确性。
因此，IPI工具将关键临床参数与MPS结合起来，成为NB风险分层的一种新颖可靠的预后工具（图11 F）。
10.代谢重编程驱动信号和分化差异分析
最后作者基于外部单细胞公共数据集验证上述结果，并剖析MPS-I NB进展的基本机制（图12A）。富集分析表明NB细胞的主要生物学功能主要与代谢途径相关如氧化磷酸化和ATP合成（图12B）。GSEA进一步揭示NB细胞在DNA合成和神经发育过程中协同上调了这些关键代谢途径（图12C-F）。CytoTRACE分析表明MPS-I NB细胞内的不同亚群表现出明显不同的分化潜能（图12G-J），这表明MPS-I NB细胞可能经历了特定的发育轨迹。
图12 代谢重编程驱动信号和分化差异分析
11.LC-MS/MS定量分析
最后作者在通过scRNA-seq阐明了MPS-I和MPS-II NB细胞中不同的代谢重编程模式之后，使用LC-MS/MS代谢组学分析了先前鉴定的MPS-I和MPS-II亚型的人NB细胞系，以进一步验证scRNA-seq结果。12个细胞系样本代谢组学分析结果表明，MPS-I和MPS-II样本表现出明显不同的能量代谢模式（图13A-B），差异代谢物之间存在显著的相互作用（图13C）。
基于SMPDB数据库的超几何富集分析反映了scRNA-seq结果，并额外揭示了一些关键的代谢重编程模式（图13D），MPS-I和MPS-II细胞组之间存在明显不同的代谢重编程模式。
图13 LC-MS/MS定量分析
文章小结
作者先是整合公共数据集获取了NB患者的相关临床信息及MRG基因信息。基于单变量Cox分析、LASSO回归和多元Cox筛选关键预后MG（PMG）并构建最终模型，并分别通过外部数据集、体外及体外模型等分析验证了该模型性能。
本文贡献在于开发了一种新的、更准确的基于代谢重编程的预后特征MPS，并制定了一种全面的治疗策略，指导相应分层NB受试者的靶向药物治疗，这些发现必将使临床肿瘤学家能够使用更有效和个性化的药物来对抗NB的进展，同时避免盲目带来的不良后果，为NB患者分层和治疗策略提供额外的视角。馆长为你提供高效的研究思路，做完轻松毕业，风里雨里馆长还在等你，需要思路设计、生信分析和服务器服务的小伙伴随时联系我哟~
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