7+乳酸化+机器学习+单细胞，超实用的模板思路！想脱颖而出的同学抓紧了！！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Immunological profile of lactylation-related genes in Crohn’s disease: a comprehensive analysis based on bulk and single-cell RNA sequencing data”，这篇文章发表在J Transl Med期刊上，影响因子为7.4。

结果：

CD患者的肠道整体表达谱

在获取了三个与CD相关的数据集（GSE16879、GSE75214和GSE112366）并消除了任何批次效应后，作者获得了226名CD患者和43名健康对照者的表达谱（图1A-D）。方差分析揭示了CD患者肠道中2751个上调基因和3064个下调基因（图1E, E, F）。这些差异表达基因进一步进行了功能和GO分析，结果显示“细胞粘附的正调节”、“细胞的顶部”和“磷脂结合”与CD强相关（附加文件2：图S1A-C）。此外，KEGG分析显示CD与“聚焦粘附”和“PI3K-Akt信号通路”之间存在强相关性（附加文件2：图S1D）。

乳酸化相关基因的表达特征

在获得上述的基因表达谱之后，作者调查了与乳酸化相关的34个基因及其表达差异。作者的研究结果显示，在CD患者中，与乳酸化相关的7个基因明显上调，而9个基因下调（图2A，附加文件3：图S2）。为了进一步验证这16个基因在结肠炎中的表达谱，作者建立了DSS诱导的小鼠模型，并通过qPCR验证了这16个基因在小鼠结肠组织中的表达谱与生物信息学分析结果一致（附加文件4：图S3）。作者对这16个表达差异明显的基因进行了功能分析。作者的GO分析显示了“组蛋白去乙酰化”、“组蛋白修饰”和“组蛋白去乙酰化酶复合物”方面的显著变化（图2C）。此外，作者的KEGG分析显示了“丙酮酸代谢”、“中性粒细胞外网形成”和“HIF-1信号通路”方面的显著变化（图2D）。最后，作者利用STRING数据库预测了16个表达差异的与泌乳相关基因的蛋白质相互作用网络（图2E）。

乳酸化的中心基因的鉴定

为了客观地确定与乳酸化相关的基因的中心基因，作者对16个差异表达基因进行了套索回归，并发现了11个基因（图3A）。作者利用随机森林分析和SVM-RFE算法对乳酸化相关基因进行排名，并确定了前10个基因（图3B，B，C）。通过对这三种方法得到的基因进行重叠分析，作者确定了6个基因作为乳酸化的中心基因，即EMB，HDAC3，HIF1A，PARK7，SIRT1和SLC16A1（图3D，D，E）。作者使用ROC评估了它们在区分克罗恩病患者和健康个体方面的潜力，发现HIF1A，SIRT1，SLC16A1和EMB具有合理的区分能力（图3F）。

CD患者关键基因的功能分析

在确定了中心基因之后，作者对这六个中心基因与其他所有基因进行了相关性分析，然后根据相关性结果进行了基于GSEA的分析（附加文件5：图S4）。EMB表达与各种营养物质的吸收呈正相关，与肠道上皮细胞的细菌侵袭呈负相关（图4A）。HDAC3表达与B细胞受体信号通路、Th细胞分化和NF-kappa B信号通路呈正相关，与TCA循环呈负相关（图4B）。HIF1A表达与NOD样受体信号通路和TNF信号通路呈正相关（图4C）。PARK7表达与脂肪和维生素的消化吸收呈负相关，与蛋白酶体和细胞周期呈正相关（图4D）。SIRT1表达与蛋白酶体、氧化磷酸化和沙门氏菌感染呈负相关（图4E）。另一方面，SLC16A1表达与自然杀伤细胞介导的细胞毒性、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路呈负相关，而与氧化磷酸化和核糖体呈正相关（图4F）。

表达的中枢基因与CD患者的免疫特征相关

作者对CD患者和健康对照组的免疫细胞浸润水平进行了分析。作者的研究结果表明，在CD患者的肠道中，23种免疫细胞中有16种的浸润水平显著增加，而有2种的浸润水平显著降低（图5A，A,B）。作者发现EMB表达与23种免疫细胞中的16种浸润水平呈显著负相关，此外，活化的CD8 T细胞和单核细胞的数量之间存在正相关（图5C）。HDAC3的表达与23种免疫细胞中的12种浸润水平呈显著正相关，与中性粒细胞的数量呈负相关（图5D）。相应地，HIF1A的表达与23种免疫细胞中的22种浸润程度呈显著正相关（图5E），而PARK7的表达与23种免疫细胞中的20种浸润水平呈显著正相关（图5F）。SIRT1表达与23种免疫细胞中的15种浸润水平呈显著负相关（图5G），而SLC16A1表达与23种免疫细胞中的12种浸润水平呈显著正相关，与6种免疫细胞呈负相关（图5H）。

使用单细胞RNA测序数据鉴定CD患者中的11个细胞群集

如图1所示，根据质量控制标准和CD scRNA-seq数据的标准化（附加文件6：图S5A-E），分析了88,322个细胞。共检查了20,527个基因，附加文件6：图S5F显示了前25个基因。接下来，使用统一流形逼近和投影（UMAP）来降低维度，成功将细胞分成11个不同的簇（res = 0.2）（图6A, A,B）。然后，使用“SingleR”功能进行细胞注释，得到了八种细胞类型的注释和表示：CD4 T细胞、B细胞、NK细胞、DC/巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和CD8 T细胞（图6C）。进行了差异表达分析，揭示了所有11个簇中的6659个标记基因的完整计数，如图6D所示。

单细胞分析验证了乳酰化与CD中的免疫相互作用

作者通过检查不同细胞类型中34个与乳酸化相关的基因的表达来评估单个细胞的乳酸化水平（图7A）。根据图表，上皮细胞、CD8 T细胞和内皮细胞的乳酸化水平得分相对较高（图7B，C）。然而，B细胞、CD4 T细胞和NK细胞显示相对较低的得分。细胞随后根据乳酸化水平进行分选，并根据中位数值将其分为高乳酸化组和低乳酸化组。作者发现B细胞的乳酸化水平相对较低，而DC/巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和CD8 T细胞显示相对较高的乳酸化水平（图7D）。最后，作者通过炎症区域对细胞进行分类和分析，结果显示乳酸化水平在炎症区域通常比非炎症区域更高（图7E）。此外，特定细胞类型（如CD4 T细胞、B细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和NK细胞）在炎症区域的乳酸化水平显著较高（图7F）。

功能聚类分析确定了与乳酰化相关的关键途径

为了进一步确定与乳酰化相关的关键途径，使用R软件包GSVA根据MSigDB数据集对每个细胞进行评分，并分析不同细胞类型中HALLMARK途径评分与乳酰化水平之间的相关性。结果发现，“OXIDATIVE PHOSPHORYLATION”、“MYC_TARGETS_V1”和“MTORC1_SIGNALING”途径在所有细胞中显示出最强的相关性（图8）。根据KEGG数据集，作者发现“KEGG HUNTINGTONS DISEASE”和“KEGG PYRUVATE METABOLISM”与乳酰化水平之间显示出最强的相关性，同时作者还发现“KEGG TIGHT JUNCTION”和“KEGG APOPTOSIS”与乳酰化水平也显示出较强的相关性（附加文件7：图S6）。根据PID数据集，作者发现“PID HDAC CLASSI PATHWAY”、“PID HDAC CLASSIII PATHWAY”和“PID MYC ACTIV PATHWAY”与乳酰化水平之间具有最强的相关性（附加文件8：图S7）。