今天给同学们分享一篇生信文章“Effects of Lipid Metabolism-Related Genes PTGIS and HRASLS on Phenotype, Prognosis, and Tumor Immunity in Lung Squamous Cell Carcinoma”，这篇文章发表在Oxid Med Cell Longev期刊上，影响因子为7.31。
脂质代谢相关差异表达基因的鉴定和突变景观
该研究的工作流程图如图1所示。3D PCA图显示TCGA数据集中的498个LUSC样本和GTEx数据集中的288个正常肺组织样本明显独立（图2(a)）。通过使用筛选阈值为|log2FC| > 1和p值 < 0.05，鉴定出了191个与脂质代谢相关的差异表达基因（DEGs），其中包括116个下调基因和75个上调基因（图2(b)和2(c)）。然后，作者总结了LUSC中191个DEGs的体细胞突变发生率。在409个LUSC患者中，228个（55.75%）发现了遗传突变（图2(d)和2(e)）。图2(d)显示了LUSC中具有前20个突变率的DEGs的突变景观。错义突变是最高分类的变异类型。单核苷酸多态性（SNP）是最常见的突变类型，C>T是具有最高发生率的单核苷酸变异（SNV）类型（图2(e)）。
差异表达基因的富集分析
GO分析显示，这191个差异表达基因主要参与了脂肪酸代谢过程、甘油脂代谢过程和磷脂代谢过程（图3(a)和3(b)）。KEGG分析富集的通路包括甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢和醚脂代谢（图3(c)和3(d)）。此外，与正常肺组织相比，LUSC中的脂质合成（图3(e)）、脂质分解（图3(f)）和脂质摄取（附图1）的代表性基因表达存在显著差异。这些结果表明了脂质代谢在LUSC中的重要性。
鉴定与TCGA队列中脂质代谢相关的预后基因
作者使用单变量Cox回归、LASSO回归和多变量Cox回归分析筛选与LUSC预后相关的DEGs。通过单变量Cox回归分析筛选出与LUSC预后相关的24个LMRGs（p值<0.05）（图4(a)）。然后，这些基因参与了LASSO回归分析，并确定了具有最佳λ值的10个基因（图4(b)和4(c)）。基于LASSO回归分析产生的基因，通过多变量Cox回归分析确定了5个独立的LUSC预后基因（图4(d)）。Kaplan-Meier生存分析检查了5个独立预后基因的表达与LUSC的OS之间的关系（图4(e)和4(f)以及附图2），其中PTGIS的高表达（图4(e)）和HRASLS的低表达（图4(f)）与LUSC的不良预后相关。
在细胞系和组织中验证PTGIS和HRASLS的表达
RT-qPCR显示PTGIS在LUSC细胞系和组织中的表达较低，而HRASLS较高（图5(a)和5(c)）。WB分析显示LUSC细胞系（NCI-H226和SK-MES-1）中PTGIS的蛋白水平显著低于肺上皮细胞系（BEAS-2B），而HRASLS显著高（图5(b)）。接下来，作者使用免疫组化（IHC）检测LUSC和配对的肿瘤邻近正常肺组织中PTGIS和HRASLS的蛋白表达，发现PTGIS的蛋白水平在LUSC中较低，而HRASLS较高（图5(d)）。
PTGIS和HRASLS对LUSC的体外增殖、迁移和侵袭产生影响
为了阐明PTGIS和HRASLS在LUSC中的作用，作者在LUSC细胞系（SK-MES-1）中进行了细胞实验。使用siRNA使PTGIS和HRASLS减少导致PTGIS（图6(a)）和HRASLS（图7(a)）水平显著下降。PTGIS敲除显著抑制了LUSC细胞的增殖、迁移和侵袭（图6(b)和6(c)），而HRASLS敲除显著促进了LUSC细胞的增殖、迁移和侵袭（图7(b)和7(c)）。PTGIS和HRASLS表达质粒导致PTGIS（图6(d)）和HRASLS（图7(d)）水平显著过表达。PTGIS过表达促进了LUSC细胞的增殖、迁移和侵袭（图6(e)和6(f)），而HRASLS过表达抑制了LUSC细胞的增殖、迁移和侵袭（图7(e)和7(f)）。综上所述，这些结果表明PTGIS和HRASLS在LUSC表型中起着重要作用。
基于PTGIS和HRASLS的LUSC一致性聚类
为了探索脂质代谢在LUSC肿瘤免疫中的作用，作者评估了独立预后基因的表达与ESTIMATE指数在LUSC中的相关性（图8(a)）。考虑到与OS和ESTIMATE指数的相关性，作者在后续分析中包括了PTGIS和HRASLS。作者比较了TCGA队列中这两个基因的表达，并发现肿瘤组织中PTGIS的表达低于正常组织（图8(b)），而HRASLS的表达高于正常组织（图8(c)）。接下来，作者根据PTGIS和HRASLS的表达分布对394例LUSC患者进行了一致性聚类，并将样本分为两个亚型（图8(d)和补充图3）。一致性聚类热图显示，在亚型1（n = 199）中，PTGIS的表达高而HRASLS的表达低，而在亚型2（n = 195）中，PTGIS的表达低而HRASLS的表达高。由于这两个基因在两个亚型中呈相反趋势，作者研究了PTGIS和HRASLS之间的Spearman相关性，并发现它们之间存在弱的负相关（R = -0.14，p = 0.0048）（图8(e)）。作者比较了两个亚型之间的临床特征差异，发现亚型1的pT、pN和pTNM分期高于亚型2（表3）。此外，亚型2的预后明显优于亚型1（图8(f)）。这些结果表明PTGIS和HRASLS将TCGA队列分为具有不同特征的两个分子亚型。
两个群集之间免疫特性的比较
为了了解两个聚类之间的功能富集差异，作者将两个聚类的所有差异表达基因（DEGs）包括在GSEA分析中。在MSigDB Collection（c5.all.v7.4.symbols.gmt）的富集分析中，作者发现了许多与免疫相关的重要通路，包括免疫应答的激活、急性炎症反应和适应性免疫应答，而这些通路在聚类2中得到了增强（图9(a)）。然后，作者使用ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA比较了两个聚类的免疫浸润情况。ESTIMATE显示聚类2的ESTIMATEScore、ImmuneScore和StromalScore较高（图9(b)–9(d)），但TumorPurity较低（图9(e)）。22种免疫细胞的浸润热图显示，在LUSC中，M2巨噬细胞的比例明显高于其他类型的免疫细胞（附图4）。CIBERSORT显示聚类2中CD8 T细胞和M1巨噬细胞的比例较高（图9(f)）。ssGSEA显示聚类2中27种免疫细胞的表达较高（如激活的B细胞、激活的CD4 T细胞、激活的CD8 T细胞和自然杀伤细胞）（图9(g)）。这些结果显示，亚型2的免疫细胞浸润比亚型1更强。
两个亚型之间基因突变的比较和免疫疗法敏感性评估
TMB水平影响肿瘤免疫浸润和免疫治疗的疗效[10]。因此，作者评估了这两个亚型的体细胞突变。图10(a)和10(b)展示了这两个亚型的突变景观，而亚型2的TMB水平高于亚型1（图10(c)）。这表明亚型2在肿瘤免疫浸润方面可能更丰富，对肿瘤免疫治疗更敏感。因此，作者首先比较了这两个亚型中常见免疫调节标志物的表达，并发现亚型2中免疫激活和INF γ信号通路标志物的表达水平明显高于亚型1（图10(d)和10(e)）。然后，作者比较了这两个亚型之间的免疫检查点的表达，以评估LUSC对免疫治疗的敏感性，并发现亚型2中与PD1相关的免疫检查点（PD1、PDL1和PDL2）的表达（图10(f)），与CTLA4相关的免疫检查点（CTLA4、CD80和CD86）的表达（图10(g)），以及其他报道的免疫检查点（LAG3、TIM3和TIGIT）的表达（图10(h)）均显著高于亚型1。
在加权基因共表达网络分析（WGCNA）中鉴定与聚类和免疫相关的模块基因
通过筛选阈值 |log2FC| > 0.8 和 p 值 < 0.05，作者鉴定出763个差异表达基因（包括697个上调基因和66个下调基因）（图11(a)）。包含394个LUSC样本和763个差异表达基因的表达矩阵被纳入WGCNA分析。样本聚类分析排除了8个异常样本，保留了386个样本（附图5）。聚类和免疫浸润评分的热图如图11(b)所示。作者选择9作为最佳软阈值（图11(c)），每个共表达网络模块的最小基因数为30，得到了7个网络表达模块（图11(d)）。为了确定与聚类和免疫相关的模块，作者分析了模块与特征之间的相关性（图11(e)）。蓝绿色模块与聚类（r = -0.77, p = 4 × 10 −78 ）和免疫（r = 0.94, p = 8 × 10 −181 ）有很强的相关性，因此将其作为后续研究的对象。最后，基于 |MM| > 0.9 和 |GS| > 0 的条件。7，作者从蓝绿色共表达网络模块（图11（f））中获得了28个关键基因（CD53，SLA，ARHGAP15，SASH3，EVI2B，GIMAP4，SELPLG，CYTH4，PTPRC，NCKAP1L，WAS，RCSD1，IL10RA，CD74，IRF8，TNFRSF1B，BTK，SNX20，APBB1IP，CD37，DOCK2，CD4，GIMAP7，LILRB1，IL16，DOCK8，CORO1A和BIN2）。
关键基因的富集分析及其与肿瘤免疫浸润的关系
作者对通过WGCNA获得的28个关键基因进行了GO富集分析，发现最重要的GO项目是免疫细胞的激活和增殖（图12(a)），并且这些过程得到了增强（图12(b)）。PPI分析显示IL10RA位于关键基因相互作用网络中（图12(c)），这些基因之间存在强烈的正相关关系（图12(d)）。关键基因与肿瘤免疫浸润分析（ESTIMATE和ssGSEA）的Spearman相关分析表明，所有关键基因与肿瘤免疫密切相关（图12(e)和12(f)）。
GEO验证PTGIS和HRASLS在评估LUSC的预后和肿瘤免疫中的作用
作者使用与TCGA队列相同的共识聚类方法将GSE4573队列分为两个亚型，并发现PTGIS和HRASLS在这两个亚型中的表达分布与TCGA队列中的类似（图13(a)）。临床病理数据的比较显示，亚型1的pN和pTNM分期高于亚型2（表4）。Spearman相关分析显示，PTGIS和HRASLS的表达水平呈负相关，与TCGA队列相似（r = -0.21，p = 0.018）（图13(b)）。生存分析显示，在LUSC中，PTGIS的高表达和HRASLS的低表达与不良预后相关（补充图6），亚型2的OS率明显高于亚型1（图13(c)）。作者使用与TCGA队列相同的分析方法比较了两个亚型之间的肿瘤免疫浸润程度，包括ESTIMATE（图13(d)–13(g)），免疫调节标志物的表达（图13(h)–13(j)），CIBERSORT（图13(k)）和ssGSEA（图13(l)）。毫不奇怪，亚型2的免疫系统更为活跃。
作者确定了与LUSC的预后和肿瘤免疫相关的LMRGs PTGIS和HRASLS。在体外实验中，PTGIS和HRASLS影响了LUSC的增殖、迁移和侵袭能力。基于PTGIS和HRASLS表达分布的共识聚类，TCGA和GSE4573队列中的LUSC患者被分为两个亚型。亚型2具有更好的预后、更强的免疫浸润、更高的免疫检查点表达和更高的TMB水平，相比之下，亚型1则较差。因此，作者的研究表明，PTGIS和HRASLS在指导LUSC的免疫治疗方面具有潜在的临床价值，同时也是预后和肿瘤免疫的生物标志物。
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