4+缺氧相关+WGCNA+机器学习，干湿结合发文不要太简单，不要纠结没思路，学起来就是了！！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Identification of hypoxia- and immune-related biomarkers in patients with ischemic stroke”，这篇文章发表在Heliyon期刊上，影响因子为4。

结果:

DEGs筛选

为了探索IS和正常状态之间基因表达差异的程度，作者挖掘了差异表达基因（DEGs）。总共筛选出4171个IS组和对照组之间的DEGs，其中包括1645个上调基因和2526个下调基因（图1A）。热图显示了前15个上调和下调的DEGs（图1B）。在200个缺氧相关基因和4171个DEGs的交集中，获得了45个DEHRGs，用于后续分析（图1C）。

免疫浸润细胞分析

由于一项现有研究专注于调查胶质细胞介导的免疫反应在IS发病机制中的作用，作者首先通过免疫浸润分析探索了AD和正常样本之间的免疫细胞浸润差异。为了获得IS和对照样本之间的差异性免疫细胞，作者将28种免疫浸润细胞的富集比例绘制成热图，如图2A所示。图2B的结果显示，IS和对照样本之间的激活CD8 T细胞、激活B细胞、CD56dim自然杀伤细胞、激活树突状细胞、效应记忆CD8 T细胞、中央记忆CD8 T细胞、自然杀伤细胞、γδ T细胞、中性粒细胞和浆细胞样树突状细胞的丰度存在显著差异（adj.p < 0.05）。

共表达网络的构建

上述差异性免疫细胞被用作通过WGCNA识别免疫相关基因的临床特征。首先，使用表达式的欧氏距离对GSE16561数据集中的样本进行聚类，以检查是否存在异常值。图3A显示存在一个异常样本。在去除异常值后，对剩余样本进行聚类，其中绿色为对照样本，橙色为IS样本。接下来，当软阈值（power）为4时，R2为0.85，这意味着连接性趋向于0（图3C）。然后，通过动态树切割算法确定了共表达网络中的17个模块（图3D）。根据图3E中的模块-特征关系，作者选择了六个相关系数大于0.6的模块（棕色、黄色、绿色、粉色、鲑色和红色）进行进一步分析。总共鉴定出了六个模块中的5426个免疫相关基因，用于后续分析。

DEHRG的鉴定和功能富集分析

然后，作者对上述模块中的45个DEHRGs和5426个基因进行了交集运算，从而确定了27个与免疫相关的DEHRGs（图4A）。作者进行了GO和KEGG富集分析，以研究这些与免疫相关的DEHRGs的潜在功能。如图4B所示，GO分析显示，与免疫相关的DEHRGs主要富集在对缺氧的反应、细胞多糖代谢过程、对氧气水平降低的反应以及多糖代谢过程中。如图4C所示，KEGG富集分析指出这些DEHRGs显著涉及脂质和动脉粥样硬化，以及HIF-1信号通路。因此，作者推测这27个与免疫相关的DEHRGs可能通过上述途径参与IS的发生和发展。

PPI网络构建和中心基因鉴定

为了探索免疫相关的DEHRGs之间的相互作用，使用STRING数据库建立了PPI网络，在该网络中除了PLAC8、RPAGD、HDLBP和MYH9之外的基因之间存在复杂的相互作用（图5A）。随后，将上述PPI网络导入Cytoscape软件，并使用MCODE插件选择核心模块以过滤出中心基因。总共确定了四个中心基因（FOS、DDIT3、DUSP1和NFIL3），用于后续分析（图5B）。中心基因的度在图5C中显示。功能相似性研究结果显示，FOS具有最高的功能相似性得分（图6）。相关性结果表明，DUSP1和FOS之间具有最强的正相关性（r = 0.81；图7）。

免疫细胞和中心基因之间的相关性分析

为了确定浸润免疫细胞与中心基因之间的关系，作者进行了相关性分析。根据研究结果，DDIT3与嗜酸性粒细胞之间存在最强的正相关关系；而DUSP1、FOS和NFIL3与中性粒细胞之间存在最强的正相关关系。此外，DDIT3、DUSP1、FOS和NFIL3与效应记忆CD8 T细胞之间存在最强的负相关关系（图8）。综合以上免疫浸润分析的结果，作者推测中性粒细胞和效应记忆CD8 T细胞在IS的发生和发展中起到了一定作用，并且这可能与中心基因有关。

GSEA分析

GSEA被用于研究IS中枢基因的作用（图9）。DUSP1、FOS和NFIL3高表达组的基因在FC gamma R介导的吞噬作用和趋化因子信号通路中均高度富集。DDIT3高表达组的基因在补体和凝血级联反应、泛酸和辅酶A生物合成中显著富集。DUSP1、FOS和NFIL3低表达组的基因主要富集在氧化磷酸化和帕金森病中。DDIT3低表达组的基因在移植排斥和氨酰tRNA生物合成中高度富集。此外，DUSP1与MAPK信号通路之间存在强大的关联。

小分子药物的筛选

对于IS患者的治疗，使用DGIdb确定了39种潜在药物（附表1），如阿司匹林、舒拉明、尼莫地平、塞来昔布、环孢素、维生素E、去铁胺、姜黄素和大豆黄酮。在本研究中，发现26种药物与DDIT3相互作用，10种药物与FOS相互作用，3种药物与DUSP1相互作用。不幸的是，在该数据库中作者无法找到任何可能特异性靶向NFIL3的小分子药物。此外，使用Cytoscape创建了药物-基因网络，其中紫杉醇可以作用于FOS和DDIT3（图10）。

潜在miRNA-中心基因调控网络的预测

为了研究中心基因的潜在调控机制，作者进行了针对中心基因的转录因子（TFs）和miRNA的预测。图11展示了一个包含36个转录因子（如YY1、ESR1、ELK1、FOXC1和SREBF2）、4个中心基因和278个miRNA（如miR-32-3p、miR-195-5p、miR-148b-3p和miR-128-3p）的相互作用网络。作者使用Cytoscape构建了一个miRNA-中心基因-TF调控网络，以了解中心基因的可能转录调控机制（见图11）。FOS是受最多miRNA调控的中心基因（受105个miRNA调控），也是受最多转录因子调控的中心基因（受11个转录因子调控）。

表达分析和ROC曲线分析的中心基因

作者观察到在IS样本中，中心基因的表达水平明显增加，与对照组相比（图12）。如图13所示，FOS、DDIT3、DUSP1和NFIL3的AUC值分别为0.830、0.744、0.785和0.874，表明这些中心基因具有良好的诊断价值。

基于参与 IS 的免疫相关基因建立的 LASSO 诊断模型

随后，使用 LASSO 算法进一步筛选 IS 的基因标记（DDIT3、NFIL3 和 FOS）从中心基因中（图 14A 和 B）。因此，作者构建了一个基于 DDIT3、NFIL3 和 FOS 的 LASSO 诊断模型，ROC 曲线表明该模型具有高准确性（AUC = 0.9188034；图 14C）。PR 和 DCA 曲线进一步表明该模型具有良好的性能（图 14D 和 E）。此外，作者在外部数据集（GSE58294）上测试了 LASSO 诊断模型。ROC 曲线验证了它保持了较高的诊断准确性（AUC = 0.9395085；图 14F）。与其他模型（例如，免疫基因相关模型）相比，先前描述的神经网络诊断模型在训练集中的 AUC 值为 0.909，在验证集中为 0.835 [34]。因此，本研究构建的免疫相关 DEHRG 相关模型表现更好。