作者 | 王宏准
审核 | 刘旋

今天给大家介绍美国德克萨斯大学奥斯汀分校的 Hal S. Alper 教授团队 2022 年发表在 Nature 上的论文 “Machine learning-aided engineering of hydrolases for PET depolymerization”。本文使用一种基于结构的机器学习算法，设计了一种稳定高活性的 PET 水解酶。

Part1摘要

塑料垃圾是一个生态挑战，酶降解为塑料垃圾回收提供了一种潜在的绿色可扩展途径。聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET，一种塑料) 占全球全球固体废物的 12%。然而，由于 PET 水解酶对 pH 和温度敏感、反应速度慢以及无法直接用于未经处理的消费后塑料，其应用受到阻碍。本文使用一种基于结构的机器学习算法设计了一种鲁棒的活性 PET 水解酶 FAST-PETase。其与野生型 PETase 相比，PET水解活性更高，反应环境更鲁棒。实验证明，来自 51 种不同热成型产品的未经处理的消费后 PET 几乎都可以在 1 周内被 FAST-PETase 完全降解。FAST-PETase 还可以在 50 ºC 下解聚整个热预处理水瓶和水瓶未经处理的无定形部分。最后，我们通过使用 FAST-PETase 降解塑料垃圾并从回收物中重新合成 PET，展示了一个闭环 PET 回收过程。总的来说，我们的结果证明了在工业规模上进行酶塑料回收的可行性。

Part2前言

PET 的酶解聚最早于 2005 年被报道，目前已知的有 19 种不同来源的 PET 水解酶 (PHE)。然而，这些酶中的大多数仅在高反应温度（在大约超过 70°C 的 PET 玻璃化转变温度附近）和高度加工的底物条件下才显示出明显的水解活性。例如，leaf-branch compost cutinase (LCC) 在 72°C 和 pH=8.0 的条件下可在 10 小时内降解 90% 的预处理消费后 PET (pc-PET)。大多数其他 PHE 在中等温度和更中性的 pH 条件下同样表现出较差的活性，极大地限制了 PET 废物的原位降解。由于 40% 的塑料废物绕过收集系统并存在于自然环境中，因此这一限制至关重要。此外，在接近环境温度下转换未经处理的消费后塑料废物将降低净运营成本。

虽然来自 PET 同化细菌的 PETase 可以在环境条件下运行，但它非常不稳定，在 37°C 下 24 小时后会失去活性。之前有一些工作尝试过增强其热稳定性、稳健性和活性。最著名的工程化 PETase 变体 ThermoPETase 和 DuraPETase 分别是通过合理的蛋白质工程和计算重新设计策略创建的。尽管这两个突变体的热稳定性和催化活性在某些条件下得到了改善，但它们在温和温度下总体上具有较低的 PET 水解活性。

Part3方法

我们假设高度集中的蛋白质工程方法不能考虑整体稳定性和活性之间的进化权衡，并且中性、基于结构的深度学习神经网络通常可以改善酶功能。为此，我们使用三维自监督卷积神经网络 MutCompute 来识别稳定突变。该算法在训练来自蛋白质数据库 (PDB) 的 19,000 多个序列平衡蛋白质结构的基础上学习氨基酸的局部化学微环境，并且可以很容易地预测蛋白质中野生型 (WT) 氨基酸未针对其局部进行优化的位置。

MutCompute 对 PETase 和 ThermoPETase 的预测结果如下图：

表格中展示了突变概率最高的 10 个位点。从这些突变中最终筛选出了四个最关键的突变：S121E、T140D、R224Q、N233K。然后讲这些突变排列组合到三个蛋白质支架上，得到 29 种变体。

Part4结果

29 可能的突变组合，有2个难以纯化。最终得到27个突变体。其中 23 个热稳定性提高。最后一个突变体是迄今为止报道的最耐高温的 PETase 突变体。

上图展示了 27 种变体的活性，其中 Thermo_R224Q+N233K 相对于其支架在 40°C 和 50°C 环境下的活性分别提高 2.4 倍和 38 倍。即本文发现的 FAST-PETase。

本文对 FAST-PETase 的结构进行了解析，与野生型的进行了对比，突变后分子间的氢键和盐桥发生了一些变化。

为了证明预测的突变的可移植性和通用性，本文将 N233K 突变引入 LCC, ICCM 和 Cut190 三种 PHE。从结果可以看出突变后热稳定性和活性都有所提高。

为了证明 FAST-PETase 在实际环境中的应用效果，本文采集了 51 种消费后的 PET 材料，测试了 FAST-PETase 对他们的降解效率。尽管它们在结晶度、分子量、厚度和添加剂方面存在异质性，但来自这一系列 PET 产品的样品都能在 1 周（最快24小时）内被 FAST-PETase 完全降解。并且可以以线性的速率降解。